研磨 -超声法提取根瘤土壤杆菌发酵产物CoQ10

钱大伟，扶教龙，吴晨奇，邱业先，施 磊，胡翠英，李良智

（苏州科技大学 化学生物与材料工程学院，江苏 苏州 215009）

研磨 -超声法提取根瘤土壤杆菌发酵产物CoQ10

钱大伟，扶教龙*，吴晨奇，邱业先，施 磊，胡翠英，李良智

（苏州科技大学 化学生物与材料工程学院，江苏 苏州 215009）

通过研磨辅助超声波法进行单因素和响应面实验，以优化根瘤土壤杆菌中辅酶Q10的提取条件。得出的最佳工艺条件为：丙酮研磨料液比为1∶6，研磨时间为5 min；超声波破碎输出功率为260 W，工作总时间为14 min，每次辐射时间1.3 s。优化后辅酶Q10的提取率可达135.82%。结果与理论值相符合，并且明显优于常规超声波法提取，因此，该方法具有一定的实际应用价值。

辅酶Q10；研磨法；超声波破碎法；响应面法；根瘤土壤杆菌

辅酶Q10（CoQ10）是一种脂溶性醌类化合物，是呼吸链中的必要成分。CoQ10具有抗氧化和清除氧自由基的功效，可预防和治疗多种疾病，在治疗心脏衰竭、延缓皮肤衰老等方面具有较广泛的应用[1]。因此，经济生产CoQ10的途径也变得尤为重要。CoQ10的生产方法一般有组织提取法、化学合成法和微生物发酵法几种，其中微生物发酵法具有成本低、不受原料限制、产品活性好和易大规模生产的特点，成为最具发展潜力和推广前景的生产方法[2]。作为胞内产物，CoQ10的提取成为整个生产过程中一个重要的工艺步骤，提取工艺的选择将直接影响到产品的得率、质量、后续的精制工艺以及产品成本等[3]。

CoQ10提取一般由超声法、皂化法或多种方法结合使用。超声法具有简便、快速、高效等优点，超声法不但可以获得较高的提取率，而且不会使胞内物质受到破坏，是提取胞内物质的常规手段[4-6]。李伟静等[7]优化超声提取条件后，CoQ10得率比碱醇皂化法提高了近6倍。为了获得更高的产品得率，常常将超声波破碎法与其他法结合使用[8]。如龙海燕等[9]使用超声辅助皂化提取黑曲霉中CoQ10，结果比常规皂化法的效率提高了55%。许芳等[10]使用酶解和冻融方法辅助超声提取光合细菌中CoQ10，提取率分别提高了5.1%和9.4%。李祖明等[11]使用酶法辅助超声波法从类球红细菌提取CoQ10，提取率也提高了91.9%。可见，超声法与其他方法结合使用，可明显提高CoQ10的提取率。

笔者采用研磨法和超声法结合的方法从根瘤土壤杆菌中提取辅酶Q10，通过对样品进行预处理，有利于后续产物的提取，且大大减少有毒有害试剂的用量和排放，对环境是友好的，而且方便大规模生产。因此，研磨法辅助超声法提取辅酶Q10，从理论上看能够提高辅酶Q10的提取率，在生产中具有较广阔的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）购自中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGM-CC）。根瘤土壤杆菌突变株为笔者所在实验室筛选获得。

1.1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖1%（w/v，下同），酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%；NaOH调pH值至7.2，121℃灭菌20 min，斜面培养基在种子培养基中添加2%琼脂。

发酵培养基：糖蜜废液 8%，玉米浆 1%，MgSO4·7H2O 0.3%，KH2PO40.2%，（NH4）2SO40.4%，NaCl 0.2%，NaOH调pH值至7.2，121℃灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌体制备

将保存于斜面的根瘤土壤杆菌接种于种子培养基中，在30℃、200 r·min-1条件下摇床培养24 h，得液体种子。按 10%的接种量接种到发酵培养基中，30 ℃、200 r·min-1摇床培养 72 h，4 000 r·min-1、离心 15 min，经蒸馏水洗涤2次后，再经真空冷冻干燥处理24 h，获得干菌体，保存备用。

1.2.2 研磨处理初始条件

精确称取0.4 g干菌体搅拌均匀，倒入研钵中，按1∶6的料液比（g·mL-1）加入丙酮与菌体混合，开始研磨计时3 min。研磨时，注意力度均匀速度稳定，尽量避免因研磨强度而造成的误差。研磨结束后，快速将其转移至旋转蒸发器中，用50℃蒸干丙酮。收集的干菌体即为CoQ10的粗提物。

1.2.3 超声波破碎提取

将得到的粗提物用8 mL无水乙醇重悬为菌悬液，冰浴超声，超声条件为：输出功率为270 W，工作总时间为10 min，每次辐射时间2 s。破碎结束后，破碎液于4℃冰箱过夜，使其析出胆固醇等杂质。次日，将细胞破碎液过滤，定容，最后用craven氏颜色试验法检测样品中CoQ10的含量。

1.2.4 CoQ10标准曲线

该方法利用在碱性条件下氰基乙酸乙酯可取代CoQ10的甲氧基生成蓝色化合物，并在波长620 nm处有最大吸收值。根据不同浓度的CoQ10标准品溶液在碱性条件下与氰基乙酸乙酯反应，测得在620 nm下的吸光度值绘制标准曲线[12]。其中CoQ10的乙醇溶液与氰基乙酸乙酯和甲醇钠的甲醇溶液体积比为5∶4∶l，反应10 min后测的吸光值Y，以吸收值Y与CoQ10浓度X（mg·L-1）做回归处理，得标准曲线，求出回归方程为：Y=57.61X，R2=0.999 6。

1.2.5 CoQ10含量测定及计算

根据不同CoQ10提取液与氰基乙酸乙酯和甲醇钠的甲醇溶液反应，测得其在620 nm下的吸光值代入标准曲线，求得其中 CoQ10含量。CoQ10得率（mg·g-1）Y=V1C/M=0.008C/0.2=0.04C。其中，V1为 CoQ10提取液体积，L；C 为提取液中 CoQ10浓度，mg·L-1；M 样品干菌重量，g。

其中，Y1为下文2.1节单因素实验中的最高CoQ10得率的平均值；Y2为每次单因素实验中CoQ10的最高得率的平均值。

1.2.6 单因素实验

在研磨辅助超声波法初始条件下，逐步改变研磨料液比、研磨时间进行单因素分析实验，分别考察其对CoQ10提取率的影响。在较优研磨条件下辅助超声波法，逐步改变超声破碎总功率、破碎总时间、每次辐射时间进行单因素实验，从而分别考察出其对CoQ10提取率的影响。

1.2.7 响应面实验

在上面单因素实验基础上，选择恰当的因素和水平，进行响应面实验，找出最优的因素和水平，得到理论预测的CoQ10提取率。

1.2.8 验证实验

在响应面分析法求得的最佳条件下，考虑到实际情况的可操作性，进行再次实验，三次平行取平均值，测得CoQ10的得率与提取率，与理论预测值作比较，来验证模型的可靠性。

1.2.9 不同破碎方法提取效果比较

将研磨辅助超声波法提取效果与单一的研磨法、单一的超声波法比较。

2 结果与分析

2.1 研磨料液比对CoQ10提取率的影响

在研磨初始条件下，改变干菌体与丙酮比例分别为 1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，以最高提取率为 100%，观察其对CoQ10提取率的影响，结果见图1。可见，当干菌体与丙酮的比例为1∶6时，对CoQ10具有最高的提取率，其得率为3.843 mg·g-1，并以此提取率为100%，下面实验均与此得率做比较，得出相对提取率。因此，选择料液比为1∶6的方式进行后续实验。

2.2 研磨时间对CoQ10提取率的影响

采用干菌体与丙酮比例为1∶6的最佳方式，研磨时间分别设定为1、3、5、7、9 min，以超声初始条件提取CoQ10，考察研磨时间对CoQ10提取率的影响，结果见图2。由图2可知，当研磨时间为5 min时，CoQ10得率达到最高为4.897 mg·g-1，提取率为127.42%。当超过5 min后，细胞内CoQ10充分释放后，由于空气中的氧气以及光照影响，CoQ10开始了降解，因而使提取率开始下降。由此，确定最佳研磨时间为5 min。

图1 丙酮研磨料液比对CoQ10提取率的影响

图2 研磨时间对CoQ10提取率的影响

2.3 超声波总功率对CoQ10提取率的影响

采用较优研磨条件下辅助超声提取CoQ10，在超声波法初始条件下改变超声总功率分别为 90、180、270、360、450 W 进行实验，考察超声总功率对CoQ10提取率的影响，结果见图3。当超声波工作总功率达到270 W时，CoQ10提取率达到127.42%，得率最高为4.897 mg·g-1。由于超声波功率主要是通过惠更斯原理以及空化作用而造成影响，超声波功率越大，造成的影响也就越剧烈。当功率小于270 W时，超声波的处理对于CoQ10的释放和在有机物中的溶解起促进作用，但是当功率超过270 W时，因为功率过大，空化作用开始对细胞结构造成破坏，导致细胞内组织破碎，影响CoQ10的提取。因此，最终确定270 W为最适功率。

图3 超声波破碎总功率对CoQ10提取率的影响

2.4 超声波破碎总时间对CoQ10提取率的影响

采用较优研磨条件辅助超声提取CoQ10，在超声波法初始条件下改变超声总时间依次在5、10、15、20、25 min进行实验。考察超声总时间对CoQ10提取率的影响，结果见图4。当超声波破碎总时间为15 min时，CoQ10提取率最高为131.50%，得率为5.054 mg·g-1。低于15 min，超声破碎不充分，细胞破碎不完全。高于15 min，超声会对CoQ10的结构造成破坏，并被空气氧化。因此，最终选定最佳超声破碎总时间为15 min。

2.5 超声波破碎每次辐射时间对CoQ10提取率的影响

采用较优研磨条件辅助超声提取CoQ10，在超声波法初始条件下改变超声破碎每次辐射时间分别为1、2、3、4、5 s进行实验。考察每次辐射时间对CoQ10提取率的影响，结果见图5。由图5可见，每次辐射时间为2 s时，CoQ10提取率达到最高为127.42%，得率为4.897 mg·g-1。低于2 s，超声波的空化作用引起的剧烈震动不足以使细胞完全破碎。高于2 s，能量过度和温度升高可能会破坏CoQ10，影响CoQ10的提取，因此，确定最佳辐射时间为2 s。

图4 超声波破碎总时间对CoQ10提取率的影响

图5 超声波破碎每次辐射时间对CoQ10提取率的影响

2.6 响应面优化提取条件

2.6.1 试验设计与结果

根据单因素研究试验的结果，选择超声波破碎功率（X1）、工作总时间（X2）、每次辐射时间（X3）三个因素确定的水平范围，用Design-Expert.V8.0.6统计分析软件设计响应面试验，进行三因素三水平，共15个实验点的响应面实验[13－14]。因素及水平见表1，实验设计及结果见表2，其中包括12个析因点实验，3个零点重复实验用于估计实验误差。

表1 响应面试验因素水平表

表2 响应面设计表及实验结果

2.6.2 回归模型建立及方差分析

通过Design-Expert.V8.0.5b统计分析软件对表2试验结果进行多元回归拟合，建立二次多项式回归模型[15-16]。以CoQ10提取率为响应值的全变量二次回归方程：Y=29.764 58+0.289 91X1+11.071 17X2-11.82750X3-3.316 67×10-3X1X2+0.039 593X1X3+0.555 67X2X3-5.635 80×10-4X12-0.397 70X22-2.433 33X32。

根据表3方差分析可知，方程自变量与因变量之间的线性关系明显，回归方程p=0.003＜0.005，回归效果显著，模型失拟项为0.076 1＞0.05，说明该模型的模式失拟项不显著。而交互项（X1X3）、（X2X3）极显著，说明超声总功率和每次辐射时间、超声总时间与每次辐射时间等因素之间的交互作用极显著。由表4模型可信度分析得该模型相关性系数R2=0.988 5，决定系数R2Adj=0.967 9，说明该模型与实验拟合良好，自变量与响应值之间线性关系显著，可用于该反应的理论推测。变化系数（CV）越低，实验的可信度和精确度越高，CV=1.16%表示实验数据可靠，分析结果可信。因此，可用此回归方程代替各组实验对实验结果进行分析和预测。根据回归方程作出不同因子的响应面分析图（图6、7、8）。由响应面分析图可见，当超声破碎功率为250-280 W、总时间为13-17 min、每次辐射时间为1-1.75 s，可以得到较高的CoQ10得率与提取率。

表3 回归模型方差分析表

表4 模型可信度分析

图6 y=f（x1，x2）响应面立体图

图7 y=f（x1，x3）响应面立体图

图8 y=f（x2，x3）响应面立体图

2.7 验证试验

在响应面分析法求得的最佳条件下，考虑到实际情况的可操作性，根据二次回归方程获得较优的超声提取条件是：超声功率260 W，超声总时间14 min，每次辐射时间1.3 s，CoQ10提取率可达到136.03%。为检验响应面分析法的可靠性，采用上述最优条件进行验证实验，三次平行取平均值，实测得CoQ10的得率为5.219 mg·g-1，提取率为135.82%，这一结果虽然与理论预测值稍有偏差，分析原因可能是每次研磨带来的误差，但是该模型仍旧可以较好地预测实际提取情况。

2.8 不同破碎方法效果比较

取相同质量的培养物分别进行研磨辅助超声波法提取（最优条件下）、单一的研磨法（1∶6料液比、研磨5 min）和单一的超声波法（2 s每次辐射时间、270 W功率超声15 min）比较提取效果。结果见表5，明显可见研磨辅助超声波法能获得更好的提取效果。

表5 三种提取方法比较

3 结语

以超声作为细胞破碎的手段，并辅以研磨的方法，力求降低有毒有害原料及中间添加剂的使用量，尽可能的提高所需产物的产量，并减少有害物质的排放。在以上目标的前提下，实验结果得到最佳工艺条件：丙酮研磨最佳料液比为1∶6，研磨时间为5 min。超声波破碎中，最佳输出功率为260 W，工作总时间为14 min，每次辐射时间为1.3 s。采用优化后的丙酮研磨辅助超声波破碎提取法，CoQ10提取率可达135.82%。这为优化CoQ10提取工艺打下基础。但该实验仍存在一定的问题，虽然尽量控制研磨强度（转速、震动频率、受力面压强大小等）、研磨界面的粗糙程度，但人为因素较大，仍存在较大的误差，且无法控制与检测。但该实验为CoQ10提取提供一个新思路，而且工业中研磨机的使用能较好的避免这些不足带来的误差。在接下来的试验中，将进一步探究较大规模的CoQ10提取工艺，并对超声波与其他破碎手段结合方面进行深入、系统的研究。

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责任编辑：李文杰

Coenzyme Q10extraction from Agrobacterium tumefaciens with grinding-ultrasonic method

QIAN Dawei， FU Jiaolong*， WU Chenqi， QIU Yexian， SHI Lei， HU Cuiying， LI Liangzhi
（School of Chemistry，Biology and Materials Engeneering，SUST，Suzhou 215009，China）

We studied the extraction of coenzyme Q10from Agrobacterium tumefaciens with grinding-ultrasonic method.Optimum working conditions were gained by single factor test and response surface experiments.The optimal conditions for coenzyme Q10extraction were as follows:the ratio of acetone 1∶6，total grinding time by acetone 5 min，output power of ultrasonic disruption 260 W，work time 1.3 s，total time 14 min.Under the optimized conditions，the extraction rate of coenzyme Q10could reach 135.82%.This method is reliable and superior to the traditional method of ultrasonic extracting，so it is of great application value.

coenzyme Q10；grinding method；ultrasonic disruption；response surface methodology；Agrobacterium tumefaciens

Q814.1

A

2096－3289（2017）04－0047－07

2016－03－26

苏州市科技计划项目（SYN201317）；苏州科技学院科研基金资助项目（XKZ201411）

钱大伟（1991-），男，江苏盐城人，硕士研究生，研究方向：生物化工，微生物育种。

*通信作者：扶教龙（1969-），男，博士，副教授，硕士生导师，E-mail：jlfu999@126.com。