胶束电动毛细管色谱法测定鼻渊舒口服液中栀子苷含量

廖晓燕，王晨露，彭惊鸿，杨雨青，钟琇，梁淑彩，肖玉秀



胶束电动毛细管色谱法测定鼻渊舒口服液中栀子苷含量

廖晓燕，王晨露，彭惊鸿，杨雨青，钟琇，梁淑彩，肖玉秀

武汉大学药学院，湖北武汉 430071

建立胶束电动毛细管色谱法测定鼻渊舒口服液中栀子苷含量的方法。以对乙酰氨基酚为内标，采用未涂层融硅石英毛细管柱（52 cm×50 μm ID，有效长度42 cm），以50 mmol/L硼砂溶液＋100 mmol/L十二烷基硫酸钠＋15%乙腈为运行缓冲液（pH＝10），分离电压25 kV，压力进样0.5 psi×10 s，检测波长238 nm。栀子苷在15.02～320.48 μg/mL范围内线性关系良好（＝0.999 5）；低、中、高浓度样品测定结果的RSD均小于1.77%，中间精密度RSD＝2.01%。鼻渊舒口服液中栀子苷低、中、高浓度样品平均回收率为97.50%，RSD＝4.43%，栀子苷的胶束电动毛细管色谱法测定结果与HPLC测定结果相符。本研究建立的胶束电动毛细管色谱法简便、快速、准确度高、精密度好，可用于测定鼻渊舒口服液中栀子苷的含量。

鼻渊舒口服液；栀子苷；胶束电动毛细管色谱法；含量测定

栀子苷为栀子的主要活性成分。现已有一些栀子苷的毛细管电泳检测方法研究[1-5]，直接用区带毛细管电泳法或利用外标法进行检测，存在结果易受其他未知成分干扰和定量检测误差较大的缺点。采用胶束电动毛细管色谱法（MEKC），利用内标法进行检测，可在一定程度上克服上述缺点。鼻渊舒口服液收载于2015年版《中华人民共和国药典》（一部），由苍耳子、辛夷、薄荷、白芷、黄芩、栀子等13味药组成，成分复杂。其为解表剂，具有疏风散热、祛湿通窍功效，广泛应用于临床[6-9]。栀子苷是配方中栀子的主要活性成分[10]，现行标准采用HPLC测定其含量，也有文献采用HPLC对其他单一有效成分进行含量测定[11-13]。本试验建立鼻渊舒口服液中栀子苷含量测定的MEKC检测方法。

1 仪器与试药

P/ACE MDQ型高效毛细管电泳仪（32 Karat工作站8.0，美国贝克曼），岛津LC-20AD高效液相色谱仪（配SPD-20A检测器、LC solution工作站），SB-3200DTN超声波清洗器（宁波新芝生物科技），ME55电子天平（梅特勒-托利多），未涂层弹性融硅石英毛细管柱（52 cm×50 μm ID，有效长度42 cm，河北永年）。

栀子苷对照品（阿拉丁公司，批号J1226047），鼻渊舒口服液（成都华神集团股份有限公司，批号140609、141211、140721），对乙酰氨基酚（武汉银河化工有限公司，批号y06092661）。乙腈、37%盐酸、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠（SDS），国药集团化学试剂有限公司；硼砂，武汉市江北化学试剂有限责任公司；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 内标贮备液 精密称取对乙酰氨基酚15.00 mg，置于100 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解并稀释至刻度，制成150 µg/mL的内标贮备液。

2.1.2 对照品溶液 精密称定栀子苷对照品20.03 mg，置50 mL量瓶中，加50%乙腈溶液溶解稀释至刻度，制成400.6 µg/mL的溶液，作为对照品贮备液。精密量取对照品贮备液2 mL，加入内标贮备液2 mL，加50%乙腈溶液溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液 精密量取本品1 mL，置于50 mL量瓶中，加入内标贮备液10 mL，加50%乙腈溶液溶解稀释至刻度，摇匀，用0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性对照溶液 取鼻渊舒口服液处方中除栀子外的其余药材，按供试品溶液配制方法制成不含栀子的阴性对照溶液。

2.1.5 运行缓冲液 精密称取硼砂3.81 g，SDS 5.76 g，置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。量取上述贮备液50 mL，加乙腈15 mL于100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，调节pH＝10，用0.45 µm微孔滤膜过滤，作为运行缓冲液。

2.2 电泳条件

采用未涂层弹性融硅石英毛细管柱（52 cm×50 µm ID，有效长度42 cm），运行缓冲液50 mmol/L硼砂溶液＋100 mmol/L SDS＋15%乙腈（pH＝10），分离电压为25 kV，压力进样为0.5 psi×10 s，检测波长为238 nm，温度为25 ℃。毛细管柱在使用前用1 mol/L氢氧化钠溶液冲洗20 min，水、运行缓冲液各冲洗10 min。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.2”项下电泳条件，分别进样分析，结果见图1，其他成分对栀子苷的峰无干扰，表明本方法专属性良好。

2.3.2 标准曲线与线性范围 精密量取一定量的栀子苷对照品贮备液和内标贮备液，加50%乙腈溶液稀释成栀子苷浓度分别为15.02、20.03、40.06、60.08、80.12、160.24、320.48 µg/mL，内标浓度为30 µg/mL的溶液，分别进样，以对照品与内标峰面积的比值（Y）为纵坐标、对照品溶液浓度（C）为横坐标，进行线性回归，得回归方程＝0.006 34＋0.019 33（＝0.999 5），表明栀子苷在15.02～320.48 µg/mL范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 由3名分析人员按“2.1.3”项下方法配制供试品溶液3份，进样分析，结果对照品与内标峰面积比值的RSD＝2.01%，表明中间精密度良好。

2.3.4 重复性试验 分别精密量取鼻渊舒口服液样品0.5、1.0、1.5 mL各3份，按“2.1.3”项下方法配制得50%、100%、150%浓度的供试品溶液，进样分析，结果对照品与内标峰面积比值的RSD分别为0.57%、0.75%、1.77%，表明重复性较好。

2.3.5 稳定性试验 精密吸取同一批号鼻渊舒口服液，按“2.1.3“项下方法配制供试品溶液共1份。分别于放置0、2、4、6、8、24 h时进样分析，对照品与内标峰面积比值的RSD＝3.85%，表明供试品溶液在24 h内较稳定。

2.3.6 加样回收率试验 精密吸取同一批号鼻渊舒口服液1 mL，按“2.1.3”项下方法配制低、中、高浓度供试品溶液，共9份，分为3组。精密吸取上述各组溶液5.0 mL于10 mL容量瓶中，3组分别精密加入“2.1.2”项下对照品溶液0.5、1、1.5 mL，并加入“2.1.1”项下内标贮备液2 mL，加50%乙腈稀释至刻度，摇匀，用0.45 µm微孔滤膜过滤，取续滤液，进样分析。结果平均回收率为97.50%，RSD＝4.43%，见表1。

表1 加样回收率试验

2.4 样品含量测定

取3批不同批号的鼻渊舒口服液，按“2.1”项下方法制备供试品溶液与对照品溶液，按“2.2”项下电泳条件分别进样分析，按内标法以峰面积计算栀子苷的含量，并与药典法HPLC测定结果比较。结果较为满意，且3个批号供试品均满足药典中栀子苷含量＞2.0 mg/mL的要求。

表2 MEKC与HPLC测定栀子苷含量结果比较

3 讨论

将栀子苷对照品溶液进行紫外扫描，发现238 nm处有较好的吸收且不受溶剂的干扰，基线平滑，故选择238 nm作为检测波长。

栀子苷易溶于水，而内标对乙酰氨基酚难溶于水，本试验考察了50%甲醇和50%乙腈作为样品溶剂的分离效果，结果50%乙腈作为溶剂时溶剂干扰小，并具有较好的峰形与分离度。

本试验采用内标法定量来克服毛细管电泳重现性差的缺点。间硝基苯甲酸、3,5-二硝基苯甲酸、对乙酰氨基酚、布洛芬、尼莫地平、甲氧苄啶等物质在238 nm有较好吸收，因此作为内标候选物进行考察。间硝基苯甲酸、3,5-二硝基苯甲酸、布洛芬、尼莫地平不出峰或迁移时间较长，甲氧苄啶被溶剂峰干扰。综合出峰时间及分离度，选择对乙酰氨基酚为内标。

本试验的电泳条件优化了运行缓冲液的种类、电解质浓度、乙腈的添加量、SDS浓度和分离电压。栀子苷在不加SDS的缓冲溶液中易受到溶剂峰干扰，因此采用MEKC，加入SDS以更好地分离待测物质。缓冲溶液考察了磷酸盐-甲醇、硼砂-甲醇、硼砂-乙腈等缓冲体系，发现在磷酸盐-甲醇缓冲体系中栀子苷不出峰，在硼砂-甲醇体系中栀子苷峰形有明显的前沿，而在硼砂-乙腈体系中栀子苷峰形较好，因此选择硼砂-SDS-乙腈体系作为电泳缓冲液。当SDS浓度及乙腈加入量一定时，考察不同浓度硼砂（40、45、50、55、60 mmol/L）对分离的影响，硼砂的浓度较低时栀子苷与溶剂有干扰，硼砂浓度过高时出峰时间较晚，综合考察选择使用50 mmol/L的硼砂，并调节缓冲液pH＝10时分离效果最好。当硼砂浓度及SDS浓度一定时，考察乙腈的加入量（5%、10%、15%、20%、25%）对分离的影响，综合考虑迁移时间与分离度，选择乙腈的加入量为15%。当硼砂浓度及乙腈的加入量一定时，考察SDS的浓度（80、90、100、110、120 mmol/L）对分离的影响，SDS浓度较低时栀子苷与内标与样品中其余未知成分有干扰，浓度过高时出峰时间较晚，易出现气泡导致断流现象，因此选择使用100 mmol/L SDS。分离电压升高，迁移速率变大，迁移时间变短，但部分峰重叠，且易产生放电现象；电压过低，则出峰时间较晚。在缓冲体系为50 mmol/L硼砂溶液＋100 mmol/L SDS＋15%乙腈时，综合基线平滑度、柱效、分离度、迁移时间、不对称因子等因素选择25 kV为分离电压。

本试验建立了以对乙酰氨基酚为内标，以50 mmol/L硼砂溶液＋100 mmol/L SDS＋15%乙腈为运行缓冲液的MEKC测定中药制剂中栀子苷含量的方法。与文献[14]测定栀子苷的MEKC相比，本试验避免采用价格相对昂贵的磺丁基-β-环糊精作为添加剂，更加经济方便。本方法与HPLC相比有机溶剂消耗少，与毛细管电泳法相比更加经济环保，同时简单准确，可作为鼻渊舒口服液的一种新型质量控制技术。

[1] 李利军,冯军,黄文艺,等.高效毛细管电泳同时分离测定栀子苷、芍药苷及丹皮酚的研究[J].分析试验室,2007,26(5)：38-41.

[2] 王洪平,周洪雷,李和光,等.高效毛细管电泳法测定栀子中栀子苷的含量[J].辽宁中医杂志,2010,37(2)：318-319.

[3] 陈玉杰.高效毛细管电泳法测定加味逍遥丸中芍药苷、栀子苷的含量[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(10)：146-149.

[4] 赵彦勇,黄文艺,程昊,等.加压毛细管电色谱在芎菊上清片中栀子苷及黄芩苷分离检测中的应用[J].分析测试学报,2015,34(10)：1147- 1151.

[5] 林青,谭晓梅,李媛,等.毛细管电泳法测定清肺抑火丸中黄芩苷、栀子苷、芒果苷的含量[J].中药材,2013,36(6)：1011-1014.

[6] 刘静,唐艺芬,朱佳.鼻渊舒口服液合西医常规治疗儿童慢性鼻窦炎53例临床观察[J].中医药导报,2016,22(5)：89-91.

[7] 杨宁,林清霞,何瑞华,等.鼻渊舒口服液联合罗红霉素治疗慢性鼻窦炎的疗效观察[J].中国现代医学杂志,2014,24(17)：110-112.

[8] 张伟军,石兴源,杨平.鼻渊舒口服液治疗鼻咽癌放疗后鼻窦炎的临床观察[J].中药药理与临床,2011,27(3)：112-114.

[9] 薛新中.鼻内镜手术联合鼻渊舒口服液治疗慢性鼻窦炎的临床观察[J].中国药房,2011,22(8)：716-717.

[10] 游伟良,平其能,孙敏捷,等.栀子苷的药理学研究新进展[J].药学进展,2012,36(4)：158-162.

[11] 于桂兰,白雪峰.高效液相色谱法测定鼻渊舒口服液中木兰脂素的含量[J].中国实验方剂学杂志,2006,12(9)：71.

[12] 富同义,宋剑锋.RP-HPLC法测定鼻渊舒口服液中黄芩苷[C]//中草药杂志编辑部.全国中药新药研究与开发信息交流会论文集,丽江：2007.

[13] 陈国宁.HPLC-ELSD测定鼻渊舒口服液中黄芪甲苷的含量[J].现代中西医结合杂志,2011,20(31)：3989-3990.

[14] 王晓可,毋福海.栀子金花丸中栀子苷含量的胶束毛细管电泳法测定[J].时珍国医国药,2011,22(9)：2084-2086.

Content Determination of Geniposide inOral Liquid by Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography

LIAO Xiao-yan, WANG Chen-lu, PENG Jing-hong, YANG Yu-qing, ZHONG Xiu, LIANG Shu-cai, XIAO Yu-xiu

To establish a micellar electrokinetic capillary chromatography method for content determination of geniposide inOral Liquid.Acetaminophen was used as an internal standard, and the separation was performed on an uncoated fused silica capillary of 52 cm × 50 µm ID (42 cm effective length) with the separation voltage of 25.0 kV. The running buffer contained 50 mmol/L borax, 100 mmol/L sodium dodecyl sulfate and 15% acetonitrile (pH=10). The sample was injected by pressure (10 s, 0.5 psi) and detected at 238 nm.Geniposide was in good linearity range of 15.02–320.48 μg/mL (=0.999 5). The repeatability (low, medium and high concentration of samples) and intermediate precision assays gave satisfactory RSD values of less than 1.77% and 2.01%, respectively. The average recovery of geniposide inOral Liquid was 97.50% and the RSD was 4.43%. The contents of geniposide determined by micellar electrokinetic capillary chromatography were in accordance with the results of HPLC analysis.The method is simple, fast, accurate and precise, which can be used for the content determination of geniposide inOral Liquid.

Oral Liquid; geniposide; micellar electrokinetic capillary chromatography; content determination

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.017

R284.1

A

1005-5304(2017)12-0068-04

（2017-03-30）

（2017-06-20；编辑：陈静）

武汉大学教学改革研究项目（JG201469、JG201670）；武汉大学实验技术项目（WHU-2014-SYJS-07）；武汉大学医学部教学改革研究项目（2016017）

肖玉秀，E-mail：yuxiuxiao2011@whu.edu.cn