西藏青稞品种甘农大7号白粉菌诱导早期应答基因SSH文库的构建及分析

徐齐君，王玉林，原红军，曾兴权，尼玛扎西*

(1.西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏拉萨850002；

2.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，西藏拉萨850002)

西藏青稞品种甘农大7号白粉菌诱导早期应答基因SSH文库的构建及分析

徐齐君1,2，王玉林1,2，原红军1,2，曾兴权1,2，尼玛扎西1,2*

(1.西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏拉萨850002；

2.省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，西藏拉萨850002)

以接种白粉菌后24 h甘农大7号材料的叶片为实验组（tester），未接种白粉菌材料的叶片为驱动组（driver），分别提取cDNA，利用抑制差减杂交技术，构建“甘农大7号”白粉菌诱导早期应答基因差减文库。对所获得的EST序列去污染后，通过与核酸和蛋白数据库进行序列同源性比对，发现其中有219条非重复序列与已知序列同源性较高。对这些序列进行GO和KEGG功能分析，发现这些注释的基因主要在信号转导、基础物质代谢等方面发挥作用。本结果为后续探究青稞品种甘农大7号抗白粉病的分子机制提供了方向及理论依据。

青稞；甘农大7号；白粉病；抑制差减杂交；EST

青稞（Hordeum vulgareL.var.nudumHook.f.）是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，是藏区人民的主要粮食之一，也是啤酒制造和工业饲料的重要原材料[1]。在大麦的生产过程中，病原菌的侵害是大麦产量下降的主要原因之一[2-4]。进行大麦白粉病抗病机制的基础研究，发掘有效的抗性基因，探索大麦抗白粉病的抗病机制，可以有效地推动大麦的生产以及对大麦的分子育种提供指导。

大麦白粉病菌 [Blumeria graminisf.sp.Hordei（Bgh）]是一类专化性的活体营养型寄生真菌，属于布氏白粉菌属、子囊菌亚门核菌纲白粉病目[5]。在长期的自然进化过程中，植物形成了一套自身独特的“防御系统”，以免自身受到外界生物和非生物的侵害。其中，抗病基因是植物抵御病原菌侵害过程的重要组成部分[6-7]。对这些抗病基因进行分析和克隆，对培育抗白粉病的大麦新品种具有重要的意义。

生物的生长、发育、代谢、凋亡等生命活动都是由不同的基因表达来控制的。基因表达的差异是生物调节生命周期的核心，研究基因的差异表达，可探究生物细胞表型差异的遗传机理，为生命过程研究提供基本信息。抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）是通过DNA差减杂交与抑制PCR技术相结合，能够高效鉴定和分离克隆差异表达基因的一门技术[8-10]。本研究以筛选得到的抗白粉病青稞材料甘农大7号为研究对象，利用抑制差减杂交技术，构建青稞接种白粉菌后24 h和未接种白粉菌材料的差减cDNA文库，探究青稞材料甘农大7号在接种白粉菌后相关基因的表达情况，为研究青稞抗病相关基因的分子机理奠定基础[11]。

1 材料与方法

1.1 材料

对西藏自治区农牧科学院核心种质资源库330份青稞材料进行室外与室内苗期白粉病感染鉴定，得到抗白粉病的材料，依次为甘农7号、C280和甘农大NFC。本研究选择甘农大7号。将青稞甘农大7号播种于塑料盆钵（170 mm×220 mm）中，在温室中生长至4叶期后，采用涂抹法接种白粉菌，作为实验组，以不接种的材料为对照组。接种后，在同等条件下培养，在24 h时收取实验组和对照组材料的叶片，并用于RNA的提取。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA提取和mRNA纯化。将甘农大7号在温室中生长至4叶期后，分别对实验组和对照组材料提取总RNA，提取方法参照Trizol（TaKaRa）的操作方法，用紫外分光光度计检测所提取总RNA的质量和浓度，然后参照Oligotex（Qiagen）的操作方法，分离和纯化mRNA。

1.2.2 抑制差减杂交及PCR产物的克隆。根据SMART PCR cDNA Synthesis Kit(Clothtech)操作方法，将mRNA合成cDNA，然后对得到的cDNA进行纯化，并在RsaⅠ酶切下产生比较短的平端片段，以便于下一步的接头连接和2次的差减杂交，具体操作方法参考PCR-Select cDNA Subtraction Kit(Clothtech)说明书。分别以未接种白粉病的材料为驱动组、接种白粉病的材料为实验组，以及以接种白粉病的材料为驱动组、未接种白粉病的材料为实验组，进行2次差减杂交，将2种差减杂交的第2次PCR产物纯化后，与 pMD-18T（Takara）连接，构建出 2个抑制差减cDNA文库。将连接产物转化感受态细胞DH5α，并涂布于含X-gal/IPTG和Amp的琼脂平板上，37℃培养过夜，随机挑取白色克隆。

1.2.3 差减文库cDNA片段大小检测、测序和序列分析。将随机挑取的200个白色克隆在37℃下培养5 h以上，取1 μL菌液作为模板，用Nested primer 1和Nested primer 2R为引物，进行PCR检测，鉴定差减杂交cDNA片段。PCR反应条件如下：94 ℃、5 min；94 ℃、10 s，68 ℃、30 s，72 ℃、1.5 min，扩增30个循环。对其中的阳性克隆进行测序。

将上述测序得到的DNA片段，在美国生物信息中心网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的核酸数据库（Blastn）和蛋白数据库（Blastx）中，进行同源核苷酸和蛋白序列比对分析。最后，通过Blast2GO软件，对所获得的ESTs序列进行GO功能注释。

2 结果与分析

2.1 总RNA和mRNA的质量检测

用Trizol提取常温处理和低温处理的甘农大7号样品总RNA后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。根据电泳条带显示，大部分RNA集中在18S和28S rRNA区域间，其中28S条带的亮度约为18S条带的1.5～2.0倍，说明提取的样品总RNA完整性较好（图1）。用紫外分光光度计检测其OD260/OD280的比值均在1.85～2.10之间，说明所提取总RNA纯度较高，可进一步用于提取mRNA。纯化后的mRNA呈现弥散状的亮带，说明mRNA质量较好，可用于下一步cDNA合成。

图1 总RNA的电泳检测

2.2 双链cDNA的合成及RsaⅠ酶切消化

按照SMARTcDNA文库合成的方法，将纯化后的mRNA合成双链cDNA。取5 μL双链cDNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示片段主要分布于200～5 000 bp之间。然后，用RsaⅠ酶切反应3 h后，产物主要集中在200～800 bp间（图2），长片段得到有效的消化，说明酶切效果较好，可用于后续的实验。

图2 dscDNA酶解后电泳图谱

2.3 差减文库的构建及鉴定

将2次差减杂交得到的差异片段进行第2次PCR扩增后的产物，与pMD18-T连接，构建出2个抑制差减cDNA文库。从每个差减cDNA文库中随机挑取200个克隆，用Nested primer 1和Nested primer 2R为引物，进行PCR鉴定，经筛选，分别得到150和124个有效阳性克隆，插入片段长度主要分布在300～750 bp之间，随机挑选了一些克隆PCR扩增结果如图3。这些阳性克隆将有利于今后分离、鉴定与之相关的基因。

图3 PCR检测cDNA差减文库克隆插入片段

2.4 ESTs序列分析

对274个阳性克隆进行测序，一共获得233条高质量的ESTs序列。将得到的233条ETSs序列与GenBank的非冗余核酸数据库和非冗余蛋白数据库进行同源性比对分析。结果表明，其中14条序列无法比对到同源序列，可能是新基因；219条序列能够在核酸和蛋白数据库中有较高的同源性，其中，在大麦、高粱、蒺藜状苜蓿、大豆、玉米、小麦等单子叶植物中具有较高的同源性（图4）。

图4 注释序列在数据库中物种同源性分布

根据在Nr数据库的比对结果，对成功注释的219条ESTs序列进行GO功能注释。结果发现，这些序列主要在生物学过程、细胞组成及分子功能这3大类功能中被注释，如在生物学过程中，主要在生物调节、生物的代谢过程及组织信号传递过程中发挥作用；在细胞组成这一大类中，主要参与构成一些细胞、大分子复合物、生物膜等；同时，在一些蛋白的绑定、转录因子的激活以及酶活性调控等分子功能中发挥作用，具体被注释的序列功能，详见图5。

通过与KEGG数据库的比对，可以分析被注释的ESTs序列在青稞代谢途径中的富集情况。利用KEGG数据库的分类，可以简单地将被注释的219条ESTs序列归类到全部的7大类代谢通路中的4类（详见图6），其中被注释到蛋白质翻译过程和新陈代谢的ESTs序列较多，分别有13和8条。对注释到4大类代谢通路的序列作进一步分析发现，其中参与能量代谢、蛋白折叠修饰、碳水化合物代谢的ESTs序列占据主导地位，分别有5、4、2条。对这些结果与GO功能注释的结果比较分析发现，参与基础代谢的这些序列在功能上具有一定相关性，并再次证明注释结果的准确性。GO功能和KEGG代谢通路的分析表明，植物对外界环境的适应过程是一个由多系统调控的生物过程。通过这些被注释的基因，将有助于对青稞病原互作过程中的分子机理的深入研究，并为培育青稞抗白粉病材料作出应有的贡献。

3 讨论

植物在生长发育过程中，经常会受到多种病原物如细菌、真菌、病毒等的侵染。在此过程中，植物进化形成了一套独特的针对病原物侵染的防卫机制[12]。在对植物与病原物之间相互协同进化关系的研究过程中，Flor在1971年提出了“基因对基因”假说[13]。该假说认为，病原菌携带的毒性基因（Vir）/无毒基因（avr）和植物体内的感病基因（r）/抗性基因（R）之间存在对应关系，只有当病原菌遇到无毒基因（avr）与寄主的抗病基因（R）互作时，植物寄主才表现出抗病性，“基因对基因”假说的提出能够解释大多数小种专化型抗性，也适用于其他多种类型的病原菌，如病毒、细菌、真菌等[14-15]。

图5 GO功能分析的结果

1：生物调节；2：组织或生物起源细胞组件；3：细胞过程；4：定位；5：代谢过程；6：多有机体生物进程；7：正调控生物过程；8：生物过程调控；9：应激反应；10：信号传导；11：单一有机体生物进程；12：细胞；13：细胞组分；14：大分子复合物；15：细胞膜；16：膜组成；17：细胞器；18：细胞器组成；19：绑定；20：催化活性；21：分子功能调控；22：核结合转录因子激活；23：分子结构活性；24：转运活性。

图6 青稞白粉病差减文库中注释基因的代谢途径分析

植物抵御病原物侵染，激发防卫机制，一般需要经过3个过程：信号识别，信号传导，防卫基因激活和表达[16]。植物R基因表达产物与病原物的avr基因产物相互识别并产生信号分子，信号分子通过信号传导系统传递到寄主细胞、组织、器官，乃至整个植株，激活植物的防卫反应相关基因，从而抑制病原物的侵入或扩展而表现为抗病性[17-18]。有研究报道，在植物与病原菌互作过程中，通常会有水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）、脱落酸（ABA）以及赤霉素（GA）等植物激素作为信号分子，参与抗病信号的传递，使寄主植物产生防卫反应[19-20]。同时，也有研究表明，植物细胞的多糖物质如细胞壁、木质素、纤维素等在植物抵御外源病原物的过程中，也发挥重要作用。这种在病菌微生物侵染后，由植物细胞壁的化学组成产生的变化或物理结构修饰所介导的抗性，称为细胞壁抗性[21]。细胞壁是植物抵御外源病原物侵染的第一道屏障，是植物防御系统中的重要组成部分。当病原物侵染时，植物会通过对细胞壁组成成分的改变、细胞膜通透性的变化等方式，如木质素的积累、胼体质的增加、细胞过氧化物酶的合成等来抵御病原物的入侵[22-23]。而白粉病菌作为一类真菌性病害，植物细胞壁是其侵染寄主细胞所必需要面对的阻碍之一[24-25]。在我们所注释的结果中，发现一些基因在多糖类代谢过程、过氧化物合成以及信号传导过程等都发挥作用，这些结果在后续深入研究青稞抗白粉病的分子机理方面将提供指导和方向。

抑制差减杂交是研究真核生物基因差异表达常用的方法之一，将不同的mRNA逆转录成cDNA，以cDNA为对象研究基因的差异表达。在前人的研究基础上，本试验以筛选得到的青稞抗白粉病材料甘农大7号为研究对象，构建差减杂交文库，并分析文库涉及到的相关表达基因。这可为后期研究青稞抗白粉病的抗病机制提供优良的材料和基因资源，为深入探讨青稞的抗病机制打下基础，并对用分子育种方法培育优良抗白粉病大麦材料提供帮助和指导。

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本刊常用计量单位符号简介

为执行国务院发布的《关于在我国统一实行法定计量单位的命令》的规定,根据中华人民共和国国家标准(GB310-3102-93)《量和单位》，现将本刊常用的计量单位符号介绍如下，希广大作者遵照执行。

时间：日(天)-d；表格(月 /日)应用(月 - 日)，如 2/30 应用 02-30；时 -h；分 -min；秒 -s；质量：吨 -t；公斤(千克)-kg；克 -g；毫克 -mg；微克 -μg；纳克 -ng；体积：升 -L；毫升 -mL；微升 -μL；浓度：克分子浓度(M):废用，改为摩尔每升mol/L；当量浓度(N):废用，换算成相应的mol/L；ppm换算为相应的mg/kg、μL/L、μmol/mol等；压强:帕(斯卡)-Pa；面积：亩 -667m2，万亩换算为万 hm2。

Construction and Analysis of SSH Library of the Tibetan Hull-less Barley(Hordeum vulagareL.var.nudumHK.f.)Variety Gannong Da 7 in Response toErysiphe graminis

XU Qi-jun1.2,WANG Yu-lin1.2,YUAN Hong-jun1.2,ZENG Xing-quan1.2,NYIMA Tashi1.2
(1.Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences,Lhasa 850002,China 2.State Key Laboratory of Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement,Lhasa 850002,China)

We used the leaves of the Tibetan hull-less barley (Hordeum vulagareL.var.nudumHK.f.)variety Gannong Da 7 inoculated with powdery mildew for 24 h as the experimental group (tester),while the non-inoculated leaves served as the driver(control).Then we extracted cDNAs from the two material groups to construct Gannong Da 7 SSH library by using suppression subtractive hybridization technology.The obtained cDNA sequences in this library were compared with those in GenBank.We randomly selected 274 positive clones for sequencing,resulting in 233 high quality ESTs.The analyses of Blast2 GO and KEGG revealed that these genes function in constituting cellular components,photosynthesis,and signal transduction.This work sheds new lights on the direction of our future research,and builds a theoretical basis on further studying the molecular mechanisms of the resistance to powdery mildew in the highland barley variety Gannong Da 7.

Hull-less Barley;Gannong Da 7;Erysiphe graminis;SSH;EST

S512.3；S432.4

A

1673-6486-20170366

徐齐君,王玉林,原红军,曾兴权,尼玛扎西.西藏青稞品种“甘农大7号”白粉菌诱导早期应答基因SSH文库的构建及分析[J/OL].大麦与谷类科学,2017,34(5):8-12，17[2017-10-15].http://kns.cnki.net/kcms/detail/32.1769.S.20171015.1740.002.html.

2017-05-31

西藏科技重大专项（Z2016B01N01）；西藏财政专项（2017 CZZX001/02）；西藏自治区自然基金（2016ZR-15-47）。

徐齐君（1984—），女，硕士，助理研究员，主要从事青稞遗传育种研究。E-mail:xuqijun_1314@163.com。

*通讯作者：尼玛扎西（1966—），男，博士，研究员，主要从事青稞遗传育种研究。E-mail:nima_zhaxi@sina.com。