基于金属—有机骨架材料的C反应蛋白传感器研制*

李志鹏， 刘 仪，2, 李云蕊， 卢明月， 杜雪婷， 杨云慧

(1.云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500； 2.昭通市疾病预防控制中心，云南 昭通 657008)

基于金属—有机骨架材料的C反应蛋白传感器研制*

李志鹏1， 刘 仪1，2, 李云蕊1， 卢明月1， 杜雪婷1， 杨云慧1

(1.云南师范大学化学化工学院，云南昆明650500；2.昭通市疾病预防控制中心，云南昭通657008)

在常温下合成了Au纳米颗粒负载的超纳米结构金属有机骨架化合物(Au NPs/SNHKUST—1)，并以其为标记材料标记C反应蛋白抗体。同时合成了中空状石墨烯纳米材料和Au纳米颗粒作为固定基质，制备了夹心型的C反应蛋白免疫传感器。通过检测标记物对H2O2还原反应的催化电流，实现了对C反应蛋白的定量测定。传感器在C反应蛋白浓度为0.2～200 ng/mL的范围内线性良好的，线性相关系数R2=0.994 7，检测下限为0.05 ng/mL，为C反应蛋白测定提供了一种新的简单快速的检测方法。

C反应蛋白； SNHKUST—1； 金属—有机骨架； 免疫传感器； 中空石墨烯

0 引 言

C反应蛋白(CRP)是一种典型的急性血浆蛋白，产生于肝细胞，由5个相同的亚基组成(每个亚基的分子量为23 kDa),为急性和全身慢性炎症的临床生物标志物。许多研究表明，高浓度的C反应蛋白与心血管疾病密切相关[1～4]。

CRP会分解成单体，同时导致热、尿素、和钙离子的缺失以及低pH值。正常情况下CRP在体内的含量极微，而在急性创伤感染心血管炎症及肿瘤疾病患者血液中的含量会急剧升高[5]，CRP还被证明与癌症[6]和新陈代谢[7]有关，因此，在临床诊断中非常重要[8]。通常，人体中CRP的正常水平小于2 μg/mL，当高于这个浓度时可能存在炎症，例如病毒感染时CRP含量为10～40 μg/mL，细菌感染时为40～200 μg/mL。

金属—有机骨架(metal-organic frameworks，MOFs)材料由芳香酸或碱的氮、氧多齿有机配体，通过配位键与无机金属中心杂化形成立体网状结构晶体，研究表明，MOFs较其他的多孔材料具有更广阔的应用前景，如可用于吸附分离氢[9]、催化剂[10,11]、磁性材料[12,13]、光学材料[14]和有毒离子的检测[15]等。

Chui等人首次报道的金属有机骨架化合物HKUST—1(Hongkong University of Science and Technology)也称为CuBTC，是由双核铜簇与均苯三甲酸配位而成的研究最广泛的MOFs材料之一[16]。SNHKUST—1[17]是超纳米结构的HKUST—1,粒径相对较小，具有更大的孔隙,在气体存储、分离、净化和催化等领域有广泛的应用。

中空石墨烯球[18～20](hollow graphene ball，HGB)呈空心球状，近年来引起广大研究者的关注，三维结构的石墨烯具有巨大的比表面积，在传感器[21]、催化电极[22]、电容[23,24]等领域有潜在的应用。

本文研制了一种以Au/SNHKUST—1纳米颗粒为标记物的夹心型免疫传感器,用于CRP的快速检测。SNHKUST—1纳米颗粒作为一种天然的模拟酶，对过氧化氢(H2O2)具有一定的催化作用，负载了Au纳米颗粒的SNHKUST—1对H2O2的催化效果更好。本文采用夹心法来检测CRP，通过电流响应信号与CRP抗原浓度之间的正比例关系，实现对CRP抗原的定量检测。

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

主要试剂及所用仪器列于表1及表2。

表1 主要试剂及厂家

表2 主要仪器及厂家

1.2 HGB的合成

参照文献[25]合成HGB。

1.3 金纳米溶胶的合成

在三颈烧瓶中加入50 mL蒸馏水，0.5 mL 1 %的氯金酸加热至沸腾后，加入1 %的柠檬酸三钠1.75 mL，继续加热至沸腾后15 min，至溶液反应成酒红色。

1.4 Au NPs/SNHKUST-1的合成

1.4.1 SNHKUST—1的合成

参照文献[26]制得SNHKUST—1纳米颗粒。

1.4.2 Au NPs/ SNHKUST—1的合成

向15 mLAu纳米溶胶中加入50 mg SNHKUST—1，常温搅拌48 h，使得Au纳米颗粒被SNHKUST—1充分吸附。

1.5 CRP抗体的标记

取1 mL的1.25 mg/mL的Au NPs/ SNHKUST—1纳米颗粒，用200 mmol/L的碳酸钠调节pH=9，向其中加入1 mg/mL的CRP抗体共10 μL，分5次加完，每次间隔3 min。之后，将离心管放至振荡器上振摇2 h，再加入25 μL 10 %BSA，封闭30 min，离心洗涤2次，最后分散在1 mL的PBS中。

1.6 CRP传感器的制备

取玻碳电极(Φ=3 mm)在金相砂纸上打磨抛光；依次在粒径为1.5，0.5～0.7 μm，30～50 nm的α—氧化铝抛光粉上打磨；分别在硝酸溶液V(HNO3)∶V (H2O)=1∶1，CH3CH2OH,去离子水中各超声洗涤10 min。自然风干后滴加0.6 mg/mL的HGB悬浊液于玻碳电极表面，晾干后用PBS冲洗未吸附的HGB，滴上10 μL Au纳米颗粒，自然晾干，再滴加10 μL的20 μg/mL CRP抗体，于4 ℃过夜。修饰好的玻碳电极用PBS缓冲溶液冲洗3次。取出电极冲洗干净，即可制得anti-CRP/Au NPs/HGB/GCE修饰传感器。CRP免疫传感器制备流程如图1所示。

图1 免疫传感器制备流程(A为CRP抗体的标记过程； B为免疫传感器的制作过程)

1.7 检测方法

电极在使用前用滴加1 % BSA 溶液，37 ℃培育1 h，封闭电极表面的非特异性结合位点。然后滴加不同浓度CRP抗原，在37 ℃培育45 min，培育时间结束用PBS冲洗未结合的抗原，再滴加10 μL标记好的 anti—CRP以进一步培育。最后在10 mL的PBS环境中，于-0.2 V的电位下用计时电流法(IT)进行测量，所有测量均在室温下进行。

2 结果与讨论

2.1 材料表征

2.1.1 中空石墨烯纳米颗粒与SNHKUST—1的微观形貌

用高倍透射电镜(TEM)观察了中空石墨烯和SNHKUST—1的纳米颗粒的微观形貌特征如图2。由图2(a)可知中空石墨烯颗粒的平均粒径为200～250 nm,外壳厚度约为5 nm，呈中空状，分散性好。由图2(b)可知,合成的SNHKUST—1颗粒呈现石头状，分散性好无团聚。

图2 中空石墨烯(a)以及SNHKUST—1(b)的TEM

为了表征所合成的材料是否和文献一致，采用X 射线(XRD)粉末衍射对所合成的材料进行表征，结果如图3所示。与文献[27]谱图进行对比，衍射峰位置一致。表明成功合成了SNHKUST—1纳米颗粒。

图3 SNHKUST—1材料的XRD

2.1.2 Au/SNHKUST—1纳米颗粒表征

对合成的Au—SNHKUST—1材料进行TEM表征，结果如图4所示,可见，金纳米颗粒粒径大小约为5 nm，分散性好，无团聚，且已经均匀负载在SNHKUST—1上，表明已成功制得了Au/SNHKUST—1纳米复合物。

图4 Au/SNHKUST—1材料的SEM

2.2 不同修饰材料电化学性能比较

为了证实Au NPs—SNHKUST—1材料对H2O2的催化作用，将玻碳电极在相同条件用壳聚糖分别固定等量的Au纳米颗粒,SNHKUST—1和Au NPs/SNHKUST—1，将其分别浸入PBS缓冲溶液中，加入100 μL1.0 mol/L的H2O2于-0.2 V下进行计时电流的测定，结果如图5所示。从图中可以看出，Au NPs—SNHKUST—1(曲线c)对H2O2的催化电流远远大于SNHKUST—1(曲线b),Au NPs(曲线a)，证实了Au NPs—SNHKUST—1材料对H2O2具有较强的协同催化作用，可产生较大的电流响应信号。

图5 不同修饰材料催化性能比较

2.3 免疫传感器循环伏安行为

图6为培育相同浓度 CRP抗原(40 ng/mL)的免疫传感器，在不同溶液中的循环伏安行为。曲线a为在10 mL 0.1 mol/L的PBS缓冲溶液(pH 7.4)中的循环伏安图，无氧化还原峰；当在10 mL 0.1 mol/L的PBS缓冲溶液(pH 7.4)中加入0.1 mol/L的H2O2时，电流急剧增加(曲线b),证实了Au/SNHKUST—1材料对H2O2具有催化作用。

图6 免疫传感器在不同溶液中的循环伏安曲线

2.4 不同修饰电极界面交流阻抗行为

图7为修饰不同物质的电极在5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的交流阻抗行为;其中曲线a为空玻碳电极(GCE)的阻抗曲线，近似为一条直线，电阻值极小，说明电子传递只受扩散控制；曲线b为中空石墨烯/壳聚糖修饰电极的交流阻抗，修饰了HGB后电阻值增大；曲线c为金纳米颗粒/中空石墨烯/壳聚糖修饰电极的交流阻抗，加了Au纳米颗粒后，导电性增大，电阻减小,其阻抗值小于曲线b。曲线d为anti-CRP/金纳米颗粒/中空石墨烯/壳聚糖修饰电极的交流阻抗，阻抗明显增大。这是由于抗体不导电，阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-的电子传递，表明电极表面已经固定了抗体；曲线e为anti-CRP/金纳米颗粒/中空石墨烯/壳聚糖修饰电极用BSA封闭后所得的交流阻抗曲线，阻抗值递增。曲线f为BSA/anti-CRP/金纳米颗粒/中空石墨烯/壳聚糖修饰电极培育50 ng/mL浓度抗原后的阻抗曲线，阻抗值进一步增大，这是因为培育抗原后，抗原与抗体发生特异性结合，形成免疫复合物，进一步阻碍了电子传递。曲线g为CRP/BSA/anti-CRP/金纳米颗粒/中空石墨烯/壳聚糖修饰电极继续与Au NPs/SNHKUST—1标记的anti-CRP免疫结合后电极的阻抗曲线,阻抗值降低，这是因为培育了Au-NPs/SNHKUST—1标记的抗体后，导电性增强。

图7 不同修饰电极界面的交流阻抗行为

2.5 实验条件优化

实验考察了固定抗体的浓度、抗原培育时间以及标记抗体培育时间对传感器响应电流的影响，结果如图8。根据实验结果，实验选择固定抗体浓度为20 μg/mL；最佳抗原的培育时间为60 min；最佳标记抗体培育时间为60 min。

图8 实验结果

2.6 传感器的校正曲线

在最佳实验条件下，培育了不同浓度的CRP，测定电极的工作曲线，如图9所示，内置图为不同浓度的CRP的i-t响应曲线。从图中可以看出，传感器在CRP的浓度范围C为0.2～200 ng/mL之间具有良好的线性关系，线性方程为I=0.631 6C+0.643 24，相关系数为R2=0.997 5，检测下限为0.07 ng/mL。

图9 免疫传感器校正曲线

2.7 CRP免疫传感器选择性

在最优条件下，分别选择100 ng/mL的癌胚抗原CEA,丙氨酸(Ala) ,甘氨酸(Gly),谷氨酸(Glu)和100 mIU/mL人绒毛促线性激素(HCG)作为干扰物质，与浓度为20 ng/mL CRP的响应电流对比,检测传感器的抗干扰情况如图10所示，结果显示,在相同条件下CEA,Gly,Glu,Ala和HCG的响应电流远小于CRP的电流。说明干扰物对CRP的检测基本未造成干扰，传感器对CRP具有较高的选择性,如图10。

图10 CRP电化学免疫传感器选择性

2.8 回收率测定

通过标准加入法，在稀释血清中加入3种不同浓度的CRP抗原，在最佳条件下进行CRP回收率的测定，结果如表3所示，3次检测的平均回收率为101.81 %，结果较满意。

表3 CRP回收率

2.9 传感器重现性与稳定性

培育50 ng/mL CRP抗原，在0.1 mol/LPBS缓冲溶液(pH7.4)中测定了电化学传感器对CRP测定的重现性。用同一玻碳电极连续测定5次，相对标准偏差为 1.58 %，具有很好的重现性。并将电极测定后洗脱放置于冰箱中保存，3天后电流保持原来的96.2 %，一周后电流保持原来的93.2 %，一个月后电流保持原来的88.2 %，表明该CRP传感器具有很好的稳定性。

3 结 论

提出了一种新型的CRP的电化学免疫传感器。通过中空石墨烯和金纳米颗粒将CRP抗体固定在电极表面，采用Au/SNHKUST—1标记CRP抗体，通过夹心法来定量检测CRP。标记在抗体上的Au/SNHKUST—1可直接催化H2O2的还原，从而对CRP的实现定量检测，通过条件优化提高了免疫传感器的灵敏度。传感器具有良好的响应性能，线性范围宽，选择性能好等特点。

[1] Hermann M,Fischer D,Hoffmann M M,et al.CRP and CD14 polymorphisms correlate with coronary plaque volume in patients with coronary artery disease-IVUS substudy of the encore trials[J].Atherosclerosis，2012,220(1):172-176.

[2] Tsai J P,Po H L,Yen C H,et al.Body composition,C-reactive protein, carotid artery remodeling and subclinical atherosclerosis in a general Taiwanese population[J].J Thromb Thrombolysis,2012,33(2):185-192.

[3] Kaptoge S,Di Angelantonio E,Lowe G,et al.C-reactive protein concentration and risk of coronary heart disease, stroke, and mortality:An individual participant meta-analysis[J].Lancet,2010,375(9709):132-140.

[4] Danesh J,Wheeler J G,Hirschfield G M,et al.C-reactive protein and other circulating markers of inflammation in the prediction of coronary heart disease[J].N Engl J Med,2004,350(14):1387-1397.

[5] Bhattacharyya A,Klapperich C M.Design and testing of a disposable microfluidic chemiluminescent immunoassay for disease biomarkers in human serum samples[J].Biomed Microdevices,2007,9(2):245-251.

[6] Allin K H,Nordestgaard B G.Elevated C-reactive protein in the diagnosis, prognosis,and cause of cancer[J].Crit Rev Clin Lab Sci,2011,48(4):155-170.

[7] Pravenec M,Kajiya T,Zídek V,et al.Effects of human C-reactive protein on pathogenesis of features of the metabolic syndrome[J].Hypertension,2011,57(4):731-737.

[8] Black S,Kushner I,Samols D.C-reactive protein[J].J Biol Chem,2004,279(47):48487-48490.

[9] Amani M E,Teresa J B.Ce(III)-doped Zr-based MOFs as excellent NO2adsorbents at ambient conditions[J].ACS Appl Mater Interfaces,2013,5(21):10565-10573.

[10] Feng D,Gu Z Y,Li J R,et al.Zirconium-metalloporphyrin PCN-222:Mesoporous metal-organic frameworks with ultrahigh stability as biomimetic catalysts[J].Angew Chem Int Ed Engl,2012,124(41):10343-10563.

[11] Hosseini H,Ahmar H,Dehghani A,et al.A novel electrochemical sensor based on metal-organic framework for electro-catalytic oxidation of L-cysteine[J].Biosens Bioelectron,2013,42(15):426-429.

[12] Hu X W,Liu S,Qu B T,et al.Starfish-shaped Co3O4/ZnFe2O4hollow nanocomposite:Synthesis,supercapacity and magnetic properties[J].ACS Appl Mater Interfaces,2015,7(18):9972-9981.

[13] Bai C H,Yao X F,Li Y W.Easy access to amidest functionalization through aldehydic C-H bond catalyzed by heterogeneous Co-based catalysts[J].ACS Catal,2015,5(2):884-891.

[14] Reinsch H,Veen M A,Gil B,et al.Structures,sorption characteristics,and nonlinear optical properties of a new series of highly stable aluminum MOFs[J].Chem Mater,2013,25(1):17-26.

[15] Xu F J,Kou L,Jia J,et al.Metal-organic frameworks of zeolitic imidazolate framework-7 and zeolitic imidazolate framework-60 for fast mercury and methylmercury speciation analysis[J].Anal Chim Acta,2013,804(4):240-245.

[16] Cai Y,Kulkarni A R,Huang Y G,et al.Control of metal-organic framework crystal topology by ligand functionalization:Functionalized HKUST-1 derivatives[J].Cryst Growth Des,2014,14(11):6122-6128.

[17] Du H Q,Bai J F,Zuo C Y,et al.A hierarchical super-nanostructure of HKUST-1 featuring enhanced H2adsorption enthalpy and higher mesoporosity[J].Crystengcomm,2011,13(10):3314-3316.

[18] 苗智颖，李 莎，秦 霞，等.多壁碳纳米管增效层层自组装构建乙醇生物传感器[J].传感器与微系统,2012,29(12):85-87.

[19] 胡晓琴,李晓霞,高楼军.多壁碳纳米管-Nafion/纳米金构建阻抗传感器研究[J].传感器与微系统,2016,35(6):21-23.

[20] 郑良军,黄娟慧,谢金灿,等.基于Pt/石墨烯纳米复合材料的甲醛电化学传感器[J].传感器与微系统,2016,35(2):81-83.

[21] Gui X C,Cao A Y,Wei J Q,et al.Soft,highly conductive nanotube sponges and composites with controlled compressibility[J].ACS Nano,2010,4(4):2320-2326.

[22] Trancik J E,Barton S C,Hone J.Transparent and catalytic carbon nanotube films[J].Nano Lett,2008,8(4):982-987.

[23] Futaba D N,Hata K,Yamada T,et al.Shape-engineerable and highly densely packed single-walled carbon nanotubes and their application as super-capacitor electrodes[J].Nature Mater,2006,5(12):987-994.

[24] Fan W,Zhang C,Tjiu W W,et al.Graphene-wrapped polyaniline hollow spheres as novel hybrid electrode materials for super-capacitor applications[J].ACS Appl Mater Interfaces,2013,5(8):3382-3391.

[25] Chae S J,Gunes F,Kim K K,et al.Synthesis of large-area graphene layers on poly-mickle substrate by chemical vapor deposition:Wrinkle formation[J].Adv Mater,2009,21(22):2328-2333.

[26] 杜海强.HKUST-1纳米结构的制备、表征和氢气吸附性能研究[D].南京:南京大学,2011.

[27] Lu G,Farha O K,Zhang W,et al.Engineering ZIF—8 thin films for hybrid MOF-based devices[J].Adv Mater,2012,24(29):3970-3974.

ResearchandfabricationofCRPimmunosensorbasedonMOFsmaterials*

LI Zhi-peng1, LIU Yi1,2, LI Yun-rui1, LU Ming-yue1, DU Xue-ting1, YANG Yun-hui1

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,YunnanNormalUniversity,Kunming650500，China;2.ZhaotongCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhaotong657008,China)

Au nanoparticles-loaded metal organic framework compounds with ultranano-structured(Au/SNHKUST-1)is synthesized at room temperature and use it as a tag to label anti C-creative protein(CRP).Hollow graphene nanomaterials and Au nanoparticles are also synthesized and utilized as immobilized matrix.The quantitative determination of CRP can be achieved by detecting the catalytic current of label to the reduction of H2O2.The response current has a good linear relationship with CRP concentration at range of 0.2～200 ng/mL with linear correlation coefficient of 0.994 7 and the lowest detection limit is 0.05 ng/mL.This immunosensor of CRP provides a new simple and rapid detection method for CRP.

C-reactive protein(CRP); SNHKUST—1; metal orgamic frameworks(MOFs); immunosensor; hollow graphene

10.13873/J.1000—9787(2017)11—0078—05

O 657.15

A

1000—9787(2017)11—0078—05

2016—09—27

国家自然科学基金资助项目(21465026,21165023)

李志鹏(1996-), 男, 研究方向为电化学及生物传感器。

杨云慧(1963-), 女, 通讯作者，博士,教授, E—mail:yyhui2002@aliyun.com。