藏药四数獐牙菜的质量标准研究

李琪，莫家祺，王艺，邱洋，杜蕾蕾，范刚

藏药四数獐牙菜的质量标准研究

李琪1，莫家祺2，王艺2，邱洋2，杜蕾蕾2，范刚2

目的：建立藏药四数獐牙菜药材的质量标准。方法：采用《中国药典》方法测定水分、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物的含量，采用显微、薄层色谱法建立药材鉴别方法，采用HPLC法测定药材中龙胆苦苷的含量。结果：确定了四数獐牙菜药材的显微鉴别特征，建立了以龙胆苦苷为指标的薄层鉴别及含量测定方法。四数獐牙菜药材中龙胆苦苷的平均含量为3.11%。结论：该方法操作简便，准确可靠，重现性好，可用于藏药四数獐牙菜药材的质量控制。

藏药；四数獐牙菜；龙胆苦苷；质量标准

四数獐牙菜Swertia tetraptera Maxim为龙胆科獐牙菜属植物，主要生长于西藏、青海、四川、甘肃等高海拔地区。四数獐牙菜为藏药“蒂达”基原植物之一，具有清肝利胆之功效，主要用于治疗黄疸型肝炎、胆囊炎等肝胆疾病[1]。现代研究表明，四数獐牙菜含有龙胆苦苷、獐牙菜苦苷及齐墩果酸等化学成分[2,3]，这些成分具有镇痛、保肝利胆、抗炎和抗菌等生物活性[4～6]。目前，已有文献采用HPLC法测定了四数獐牙菜中龙胆苦苷等成分的含量[2,3]，但四数獐牙菜药材规范化的质量标准研究未见文献报道。为了提高藏药四数獐牙菜的质量控制水平，本研究首次建立了四数獐牙菜药材完善的质量控制标准，包括水分、总灰分及酸不溶性灰分检查，浸出物测定，显微鉴别和薄层鉴别，并且采用HPLC法测定了四数獐牙菜药材中主要有效成分龙胆苦苷的含量，为其开发利用和质量控制提供了科学依据。

1 仪器与试药

美国Agilent 1260高效液相色谱仪；Sartorius BP121s电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；CQ-250超声波清洗器（上海必能信有限公司）。龙胆苦苷对照品购于中国食品药品检定研究院（批号110770-200308），乙腈为色谱纯（Fisher），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。本研究共收集6批四数獐牙菜药材样品，经成都中医药大学范刚副研究员鉴定为龙胆科獐牙菜属植物四数獐牙菜Swertia tetraptera，详细信息见表1。

表1 药材来源

2 方法与结果

2.1 水分、总灰分、酸不溶性灰分的测定

水分测定参照《中国药典》2015年版四部通则0832第二法；总灰分和酸不溶性灰分测定参照《中国药典》2015年版四部通则2302。6批样品的水分、总灰分、酸不溶性灰分的测定结果见表2。水分的平均值为9.03%，总灰分的平均值为5.34%，酸不溶性灰分的平均值为3.22%。

2.2 浸出物的测定

取各批次小檗皮药材粉末约2 g，精密称定，以30%乙醇作为提取溶剂，参照《中国药典》2015年版四部通则2201项下的热浸法测定，结果见表2。浸出物的平均值为25.87%。

表2 四数獐牙菜中水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物及龙胆苦苷含量测定结果

2.3 显微鉴别

取6批四数獐牙菜药材样品，分别粉碎，按照显微鉴别法（《中国药典》2015年版四部通则2001），观察其粉末的显微特征。本品粉末灰绿色至黄棕色。纤维单个散在或成束，直径10～18 μm。气孔多见或少见，保卫细胞肾形或半月形，多未见副卫细胞。薄壁细胞类方形。木栓细胞长方形，排列紧密。花粉粒淡黄色，多见，呈类圆形，有三个萌发孔，表面有细小雕纹，直径25～30 μm。导管多为螺纹，可见具缘纹孔导管及网纹导管，直径12～20 μm。见图1。

图1 四数獐牙菜药材粉末的显微特征图

2.4 薄层色谱鉴别

2.4.1 对照品溶液的制备 取龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 取本品粉末0.5 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.4.3 薄层色谱条件及结果 照薄层色谱法(《中国药典》2015年版第四部通则0502)试验，吸取对照品和供试品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(10:2:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，见图2。

图2 四数獐牙菜药材中龙胆苦苷的薄层色谱鉴别图谱

2.5 四数獐牙菜药材中龙胆苦苷的HPLC含量测定

2.5.1 色谱条件 InertSustain® C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：275 nm；流动相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（20:80），恒度洗脱。在此色谱条件下，龙胆苦苷与其他色谱峰分离度良好。对照品溶液和供试品溶液的HPLC色谱图见图3。

2.5.2 对照品溶液的制备 取龙胆苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇配置成浓度为1.048mg/mL的溶液，即得。

2.5.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.5.4 线性关系考察 分别取龙胆苦苷对照品溶液（1.048 mg/mL）2、5、8、12、15、20 μL注入高效液相色谱仪，测定其峰面积，以对照品峰面积值为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，进行线性回归，得龙胆苦苷的回归方程为Y=1268.5X+151.29，r2=0.9999，龙胆苦苷在2.096～20.96 μg范围内呈良好的线性关系。

2.5.5 精密度试验 取四数獐牙菜药材粉末约0.5 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，按“2.5.1”项下方法连续进样6次，记录峰面积，计算含量，结果龙胆苦苷含量的RSD值为0.18%，RSD＜3%，表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性试验 取四数獐牙菜药材粉末约0.5 g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，分别精密吸取该供试品溶液10 μL，于0、1、2、4、6、12、24 h时测定其峰面积，计算含量，结果龙胆苦苷含量的RSD值为0.32%，RSD＜3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.7 重复性试验 取四数獐牙菜药材粉末约0.5 g，共6份，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，在上述色谱条件下，分别精密吸取该供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，测定其峰面积，计算含量，结果表明六份样品中龙胆苦苷含量的RSD为1.90%，RSD＜3%，表明该方法重复性良好。

2.5.8 加样回收率试验 取同一批已知含量的四数獐牙菜药材粉末6份，每份约0.1 g，精密称定，置不同的锥形瓶中，按已知含量的100%加入龙胆苦苷对照品，按供试品溶液制备方法制备，依次测定龙胆苦苷的含量，并计算回收率，结果见表3。龙胆苦苷的加样回收率在95～105%之间，平均回收率为96.82%，RSD为1.36%。

表3 龙胆苦苷加样回收率结果

2.5.9 样品含量测定 精密称取不同批次四数獐牙菜药材粉末，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下依次测定，计算龙胆苦苷的含量。结果见表2。

3 讨论

3.1 指标成分的选择

四数獐牙菜主要含有龙胆苦苷、獐牙菜苦苷及齐墩果酸等有效成分[2,3]。现代研究表明[4]，龙胆苦苷具有良好的抗炎、镇痛、保肝利胆等作用，这与四数獐牙菜的临床功能主治相吻合。因此，本文选择龙胆苦苷作为四数獐牙菜药材的薄层鉴别及含量测定的指标性成分。

3.2 浸出物的测定

在浸出物测定试验中，本文考察了冷浸法与热浸法对提取效率的影响，结果热浸法测得的浸出物含量较高。此外，分别考察了4种提取溶剂(水、30%乙醇、60%乙醇和95%乙醇)对浸出物提取的影响，结果以30%乙醇所得的浸出物含量最高，因此选择30%乙醇作为四数獐牙菜浸出物测定的提取溶剂。

3.3 含量测定

本研究采用常规的高效液相色谱法，测定了不同产地四数獐牙菜药材中龙胆苦苷的含量，结果6批药材的龙胆苦苷平均含量（以干燥品计）为3.11%。此外，研究发现不同产地四数獐牙菜药材的龙胆苦苷含量有较大的差异，其中四川省阿坝州红原县刷经寺的药材中龙胆苦苷含量最高(5.26%)，甘肃省卓尼县申藏乡次之(4.58%)，而青海省黄南州同仁县的四数獐牙菜药材中龙胆苦苷含量最低(1.42%)，这可能是由于土壤、气候等生态因子的不同影响了药材中龙胆苦苷成分的形成和积累。

3.4 限量标准制定建议

本研究收集的6批样品来自四川、青海、甘肃等高原藏族地区，样品具有代表性，研究结果能充分反映四数獐牙菜药材的实际情况。根据测定结果，按照《中国药典》中药质量标准研究制定技术要求，并参考《中国药典》2015年版中龙胆、秦艽等龙胆科类药材质量标准，建议规定四数獐牙菜药材的水分不得过11.0%，总灰分不得过7.0%，酸不溶性灰分不得过4.0%；照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用30%乙醇作溶剂，浸出物不得少于20.0%；按干燥品计算，本品含龙胆苦苷（C16H20O9）不得少于1.50%。

[1] 西藏、青海、四川、甘肃、云南、新疆卫生局. 藏药标准[S]. 西宁: 青海人民出版社,1979: 82.

[2] 梁永欣, 林鹏程,卢永昌,等. 高效液相色谱法同时测定四数獐牙菜中4种有效成分含量[J]. 安徽农业科学,2006,(10):2163-2164.

[3] 王延花,孙菁, 周国英, 等. 三种獐牙菜属植物中6种苷类成分的HPLC法测定[C]. 第五届色谱学术报告会暨甘肃省第十届色谱年会论文集, 2008, 159-163.

[4] 王焱, 曾文雪, 宋小玲, 等. 龙胆苦苷药学研究进展及其临床配伍应用[J]. 西北药学杂志, 2012,(5):502-505.

[5] 李宏亮, 白敏, 宋秋艳, 等. 天然活性成分獐芽菜苦苷的研究进展[J]. 云南中医学院学报, 2011, (4):66-70.

[6] 昌盛, 李龙. 齐墩果酸药理作用研究进展[J]. 广州化工, 2011,(14):30-32.

Study on the quality standard of Tibetan medicine Swertia tetraptera Maxim.

/LI Qi1, MO Jia-qi2, WANG Yi2, QIU Yang2,DU Lei-lei2, FAN Gang2//(1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan;2. School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:To establish the quality standard of Swertia tetraptera Maxim.(S.tetraptera).Method:The moisture,total ash, acid-insoluble ash and alcohol-soluble extract were detected according to the procedures recorded in Chinese Pharmacopoeia (2015 edition). The medicinal material was identified by microscopy and thin-layer chromatography (TLC)methods, and gentiopicroside was detected by HPLC method.Result:Microscopic characteristics of S. tetraptera were clarified.TLC and quantitative analysis method were established with gentiopicroside as index. The average content of gentiopicroside in S.tetraptera was 3.11%.Conclusion:The established method is simple to operate, having good stability and reproducibility, and can be used for quality control of S. tetraptera in the future.

Tibetan medicine; Swertia tetraptera Maxim.; gentiopicroside; quality standard

R 282

A

1674-926X(2017)05-004-03

成都中医药大学科技发展基金(ZRQN1637).

1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137；2.成都中医药大学民族医药学院，四川 成都 611137。

李琪，硕士研究生，研究方向为民族药质量评价研究 Email: nikki777@qq.com

范刚，博士，副研究员，研究方向为民族药质量标准及药效物质基础研究Tel:(028)61800160 Email:fangang1111@163.com

2017-03-09

（责任编辑：）