中药白及与黄花白及的UPLC指纹图谱研究

陈美君，李峰庆，陈鸿平，刘珈羽，刘友平

中药白及与黄花白及的UPLC指纹图谱研究

陈美君，李峰庆，陈鸿平，刘珈羽，刘友平

目的：建立中药白及与黄花白及的UPLC特征指纹图谱，同时对二者的特征指纹图谱进行比较，为二者的质量等同性评价提供参考。方法：采用Agilent ZORBAX EP C18(3.0×100mm，1.8μm) 色谱柱，以乙腈-0.1%磷酸水为流动相，梯度洗脱，流速0.6mL·min-1，检测波长280nm，柱温30℃，进样量1μL。分别建立了白及与黄花白及的UPLC指纹图谱方法并评价了多批次的相似度，二者均得到15个相同的共有峰。同时将14批白及、14批黄花白及以及3批小白及合并在一起进行相似度评价。结果：除2批（S7、S11）白及样品相似度较低外，其余29批样品之间的相似度均高达0.85，提示白及与黄花白及、小白及相似度较高。聚类分析及主成分分析结果与相似度评价相一致。结论：该方法可用于白及药材质量评价。从指纹图谱结果来看，白及、黄花白及、小白及所含化学成分类似，可为三者质量等同性评价做一参考。

白及；黄花白及；特征指纹图谱；UPLC；质量等同性

白及为兰科植物白及（Bletilla striata(Thunb.)Reiehb.f.）的干燥块茎。白及始载于《神农本草经》，列为下品，在我国药用历史悠久，疗效显著[1]。主产于贵州、四川、云南、安徽、浙江、甘肃及长江以南地区。近年来随着白及的应用范围不断扩大，用量不断增加，而白及资源遭自然及人为因素破坏，野生白及资源濒临枯竭，造成市面上供不应求，受白及植株繁殖困难影响，人工栽培白及还未能改善这一现状，导致白及价格居高不下。白及属在我国共有4个种，其他种如黄花白及（Bletilla ochracea Schltr.）、小白及（Bletilla formosana(Hayata) Schltr.）、华白及（Bletilla sinensis (Rolfe)Schltr.）等均收录于各地药材标准中作为药材入药，因与白及的外观形状差异很小，目前市场上也有许多将这三种混入或者直接当作白及出售，目前对四者化学成分、品质评价方面的研究还处于较初级阶段。本课题组拟采用UPLC建立白及以及黄花白及、小白及药材的特征指纹图谱，较全面的研究白及与黄花白及所含化学成分种类及含量的相似度，为三者药材品质评价提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1290型UPLC(DAD检测器，Agilent OpenLAB工作站，安捷伦科技有限公司)；DSY-2-4孔恒温水浴锅（北京市国华医疗器械厂）；BP211D型电子分析天平(十万分之一) (德国Sartorius公司)；BP121S型(万分之一) (德国Sartorius公司)。

1.2 试剂

对照品双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）（批号15122224）为中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯(Sigama 公司) ，磷酸、甲醇为分析纯，水为自制超纯水；样品部分收集于药材市场，部分为课题组采集，经ITS2进行DNA条形码鉴别，共确认18批白及样品，18批黄花白及样品及3批小白及样品，样品具体信息见下表1。

表1 样品具体来源信息表

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX EP C18色谱柱(3.0×100mm，1.8μm)，流动相乙腈（B）-0.1%磷酸水(A)，按下表2进行梯度洗脱，流速0.6mL·min-1，检测波长280nm，柱温30℃，进样量1μL。

表2 流动相梯度表

2.2 对照品溶液的制备

取militarine对照品适量，精密称定，用甲醇溶解并配制成质量浓度为0.984mg·mL-1的对照品溶液，冷藏备用。

2.3 供试品溶液的制备

取样品粉末约0.5g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入70%乙醇25mL，称定重量，加热回流30min，放冷至室温，称重，以70%乙醇补足减失的重量，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 取同一供试品溶液（S11），按“2.1”项下方法连续进样6次，记录其特征图谱。将测量结果采用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）”软件分析色谱图，并计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值（见表3、4）。结果，各色谱峰相对保留时间的RSD值为0.064～0.501 %之间、相对保留峰面积的RSD值为1.091～3.465% 之间，符合特征图谱技术要求（RSD＜5%），表明仪器精密度良好。

表3 精密度试验相对保留时间结果

表4 精密度试验相对峰面积结果

2.4.2 重复性试验 取同一供试品（S11）6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下方法进样测定，将测量结果采用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）”软件分析色谱图，并计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值（见表5、6）。各色谱峰相对保留时间的RSD值为0.020～1.545 %之间、相对保留峰面积的RSD值为1.252～3.695% 之间，符合特征图谱技术要求（RSD＜5%），表明样品制备方法重复性良好。

表5 重复性试验相对保留时间结果

表6 重复性试验相对峰面积结果

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液（S11），在0、2、4、8、12、24h分别进样，按“2.1”项下方法测定，将测量结果采用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004 A版）”软件分析色谱图，并计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值（见表7、8）。各色谱峰相对保留时间的RSD值为0.035～0.135 %之间、相对保留峰面积的RSD值为0.851～3.340% 之间，符合特征图谱技术要求（RSD＜5%），表明供试品溶液在24h内检测结果差异较小，稳定性良好。

表7 稳定性试验相对保留时间结果

2 0.5730.5720.5730.5720.5730.5720.111 3 0.5910.5900.5910.5910.5910.5900.117 4 0.6920.6910.6920.6910.6910.6900.097 5 0.7870.7860.7870.7870.7870.7860.070 6 0.9650.9640.9640.9640.9640.9640.035 7(S)1111110 8 1.1921.1931.1931.1941.1941.1930.042 9 1.3391.3401.3411.3421.3431.3420.106 10 1.5061.5071.5071.5061.5071.5060.044 11 1.6491.6511.6501.6501.6521.6500.055 12 1.7971.8001.8011.8021.8031.8010.112 13 1.8481.8511.8511.8511.8531.8510.086 14 1.9591.9631.9631.9651.9661.9640.128 15 2.0982.1022.1012.1022.1042.1010.099

表8 稳定性试验相对峰面积结果

2.5 白及与黄花白及特征指纹图谱的建立及比较

2.5.1 白及特征指纹图谱的建立 将14批白及按“2.3”项下方法制备供试品溶液，militarine对照品按照“2.2”项下对照品溶液配制方法进行配制，各供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录UPLC图谱，见图1。将上述所得的14批白及样品图谱进行统一积分后，将图谱以AIA.格式依次导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价软件（2004 A版）”软件，以S1（对照药材）样品为参照图谱，中位数建立14批白及药材的特征指纹图谱，见图2，共得到15个共有峰。将白及对照指纹图谱（R）相似度指定为1，计算其他14批样品指纹图谱与对照指纹图谱（R）之间的相似度值，在0.865～0.983之间，结果见表9。

表9 14批白及样品的相似度

2.5.2 黄花白及特征指纹图谱的建立 将“2.5”项下所得的14批黄花白及与3批小白及样品图谱进行统一积分后，将所有图谱以AIA.格式依次导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价软件（2004 A版）”软件，以S15样品为参照图谱，中位数法进行指纹匹配，建立了14批黄花白及药材的指纹图谱共有模式，见图2，共得到15个共有峰。将黄花白及对照指纹图谱（R）相似度指定为1，计算其他14批样品指纹图谱与对照指纹图谱（R）之间的相似度值，在0.604～0.981之间，结果见表10。

表10 18批黄花白及与3批小白及样品的相似度

2.6 白及与黄花白及的特征指纹图谱的比较

2.6.1相似度评价 以“2.5.1”与“2.5.2”项下所得14个白及与14个黄花白及样品特征指纹峰的相对峰面积值作为变量（下表11），采用“中药指纹图谱相似度评价软件（2004 A版）”软件对18批白及与18批黄花白及、3批小白及药材指纹图谱进行相似度计算。结果样品S7与S11相似度较小以外（分别为0.628、0.745），其他样品的相似度均大，说明整体上白及与黄花白及、小白及之间相似度较高，运用指纹图谱较难区别开来。结果见表12。

图1 空白溶剂、对照品、白及、黄花白及图谱

图2 14批白及样品的UPLC指纹图谱

图3 14批黄花白及与3批小白及样品的UPLC指纹图谱

表11 14批白及、14批黄花白及与3批小白及药材指纹图谱共有峰相对峰面积

表12 18批白及、18批黄花白及与3批小白及样品的相似度

2.6.2 聚类分析 运用SPSS21.0软件对39批样品进行系统聚类分析，将15个共有峰相对于参比峰峰面积量化，经标准化处理后，采用组间联结法（average linkage between groups），以平方欧氏距离（Squared Euclidean distance）为度量标准，进行聚类分析，结果见图4。由下图可以看出，在距离为5时，除样品S21、S29外，白及与黄花白及、小白及样品均未分开，可见结果与相似度评价结果相一致。

图4 14批白及、14批黄花白及与3批小白及样品的聚类分析树状图

图5 14批白及、14批黄花白及与3批小白及样品的主成分分析载荷图

2.7 主成分分析

对31批样品的15个共有峰相对于参比峰的峰面积量化后，对数据进行标准化处理后，采用SPSS21.0软件进行主成分分析，以主成分的特征值及贡献率作为选取主成分的依据，主成分个数选取原则是取主成分相对应的特征值大于1，从15个因素中总共选取了3个主成分，其累积贡献率达到94.23%，包含了15个共有峰的大部分信息。图5为14批白及样品、14批黄花白及样品及3批小白及样品的载荷图。由图可以看出，除相似度较低的2批黄花白及样品S21、S29分开较远外，其他样品均聚在一起，基本上区分不开白及、黄花白及和小白及，结果与聚类分析及相似度评价相一致。

3 结论与讨论

3.1 本课题组对来自四川、贵州、云南的14批白及、14批黄花白及以及3批小白及进行特征指纹图谱研究及比较。采用UPLC采集3个品种样品化学成分的图谱信息，并结合中药特征指纹图谱相似度评价软件对各种内样品及种间样品进行相似度评价，同时采用系统聚类方法进行聚类分析，并进行主成分分析。通过观察白及与黄花白及之间的特征指纹图谱，以保留时间作为定性鉴别依据，发现白及与黄花白及、小白及相似度较高，所含的共有峰基本一致，说明白及与黄花白及所含化学成分类似；将14批白及、14批黄花白及以及3批小白及合并在一起进行相似度评价，结果发现，除2批（S7、S11）白及样品相似度较低外，其余29批样品之间的相似度均高达0.85，提示白及与黄花白及、小白及相似度较高，聚类分析及主成分分析结果与相似度评价相一致。目前已有报道白及与黄花白及中化学成分、药效等相似[2～4]，提出可将黄花白及收入药典标准中作为白及药材的另一来源，既规范白及药材市场秩序，同时可缓解白及药材资源匮乏问题，但相关研究较少，缺乏系统性研究。本研究通过特征指纹图谱得出白及与黄花白及化学成分类似，从指纹图谱来看区分不开，可为二者等同入药提供参考依据；对于二者质量等同性还需通过药效学、安全性评价等作进一步研究。

3.2 根据2015版《中国药典》中白及项下形状描述，对几批相似度较低的样品进行分析发现，2批（S7、S11）白及样品外观与其他药材相差甚远，药材干枯，无爪状分支，易折断，且断面纤维性很重，角质化弱或没有，判断这些样品质量较差；再结合图谱分析，发现这两个样品所含共有峰较少，且各共有峰峰面积较小，所以导致相似度低。由此可见，该特征指纹图谱能鉴别白及或黄花白及药材的质量优劣，为白及、黄花白及药材品质评价提供参考。

3.3本研究所用样品大部分来源于药材市场，部分样品采自药材种植基地。从药材市场收集到的样品鱼目混杂，从形状上很难鉴别品种，因此本实验参考陈士林[5]方法，采用ITS2引物对所收集到的样品进行

DNA鉴别，共鉴别18批白及，18批黄花白及与3 批小白及。

3.4 由以上结果可得出，白及、黄花白及、小白及所含化学成分类似，可为三者质量等同性评价做一参考。本次试验所用样品数量有限，且产地集中在四川、贵州、云南3省，小白及样品收集批次相差甚远，后期应加大样本量，扩宽样品来源范围，进行深一步研究与探讨。

[1] 国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社, 2015,103.

[2] 武坤毅.两种白及内生菌多样性T-RFs指纹图谱分析及与白及多糖含量相关性研究[D].陕西师范大学,2013.

[3] 苏钛,李学芳,邱斌,等.滇产习用白及类药材的生药学研究[J].现代中药研究与实践,2015,06:18-21.

[4] 赵艳霞,邓雁如,张晓静,等.白及属药用植物化学成分及药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发,2013,08:1137-1145.

[5] 陈士林,姚辉,韩建萍,等.中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[J].中国中药，2013,38(2):141-148.

Study on UPLC fingerprints of Rhizoma Bletillae and Bletilla ochracea

/CHEN Mei-jun, LI Feng-qing, CHEN Hongping, LIU Jia-yu, LIU You-ping//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective:This study was to establish the UPLC fingerprint of Rhizoma Bletillae and Bletilla ochracea,and compare the characteristics of the fingerprints to evaluate the equivalence property of the two varieties.Method:The chromatographic condition was as follows: Agilent ZORBAX EP C18(3.0×100 mm,1.8 μm) eluted with the mobile phases of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid water in gradient mode. The flow rate was 0.6 mL·min-1, and the detection wavelength was set at 280 nm. The column temperature was 30℃ and sample size was 1μL. Similarity analysis was used to analyze the UPLC fingerprints of 14 batches of Rhizoma Bletillae and Bletilla ochracea. The common mode of the UPLC characteristic chromatographic profile was set up. There were 15 common peaks. 14 batch Rhizoma Bletillae, 14 batch Bletilla ochracea and 3 batch Bletilla formosana were merged together for similarity evaluation.Result:The results showed that except 2 batch Rhizoma Bletillae ( S7, S11) which did not reach the 0.85, the remaining similarity of 29 batch samples were 0.85 which indicated that the three varieties had a high similarity. The results of cluster analysis and principal component analysis were consistent with similarity evaluation.Conclusion:This method can be used to assess the quality of Rhizoma Bletillae. The fingerprint results show that Rhizoma Bletillae, Bletilla ochracea and Bletilla formosana contain similar chemical composition which can be used as a reference for the evaluation of the equivalence property of the three varieties.

Rhizoma Bletillae; Bletilla ochracea; characteristic fingerprint; UPLC; quality equivalence

R 282

A

1674-926X(2017)05-003-07

四川省科技厅科技支撑计划项目（2016SZ0038）；成都市科技局科技项目（2014-HM01-00407-SF）

成都中医药大学药学院 中药材标准化教育部重点实验室 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 611137

陈美君（1990-），女，在读硕士，从事中药化学成分与质量标准化研究Tel:15308091445 Email:275474711@qq.com

刘友平（1964-），女，博士，从事中药化学成分与质量标准化研究Tel:(028)61800103 Email:liuyouping00@163.com

2017-03-23

（责任编辑：胡慧玲）