大苞水竹叶组培快繁及再生体系的建立

李翠+韦莹+李林轩+郭晓云+赵以民+张占江

摘要：拟采用组织培养快繁技术解决大苞水竹叶种苗短缺和种质资源可持续开发利用的问题，从而为人工种植提供技术支持。对消毒剂、消毒时间进行筛选，以大苞水竹叶侧芽为外植体，以MS、B5、N6为基本培养基，采用正交设计研究植物生长调节剂多因素组合[6-BA、KT、NAA、IAA、IBA、活性炭（AC）]对大苞水竹叶进行初代诱导、不定芽分化和诱导生根的影响。结果表明，体积分数为0.1%的氯化汞为最佳灭菌剂，灭菌时间为8 min时诱导率最高，最佳培养基为MS培养基；不定芽最佳诱导培养基为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L KT，外植体经15 d诱导培养，可分化形成11个不定芽；MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L IAA最利于不定芽继代增殖；MS+2.0 mg/L IBA+1.0 mg/L IAA最适于诱导生根获得再生植株，生根率93.1%；生根苗宜移栽于泥炭+黄沙（体积比 3 ∶1）的基质上，成活率84%。由结果可以看出，该组培快繁途径繁殖速度快、再生率高，有望为栽培大苞水竹叶提供大量种苗，为壮药深入开发利用研究提供依据。

关键词：大苞水竹叶；壮药；组培快繁；再生体系

中图分类号： Q945.51 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）19-0143-03

收稿日期：2016-04-28

基金项目：广西中医药民族医药标准化课题（编号：GZBZ14-15）；广西壮药质量标准研究项目（编号：MZY2013052）。

作者简介：李 翠（1982—），女，黑龙江依安人，硕士，助理研究员，主要研究方向为药用植物繁育与保存。Tel：（0771）5602850；E-mail：licuicui941@aliyun.com。

通信作者：张占江，博士，副研究员，研究方向为药用资源保护与开发利用。Tel：（0771）5603824；E-mail：zzj1811@163.com。 大苞水竹叶{Murdannia bracteata（C. B. Clarke） O. Kuntze[Aneilema bracteata （C. B. Clarke） O. Kuntze]}为鸭趾草科水竹草属植物[1]，是著名的壮药痰火草的源植物，为多年生常绿草本。大苞水竹叶根呈圆柱状，长20～30 cm，花期5—8月，果期6—9月，主要生长在海拔500～850 m的水沟边及密林下，分布于广东、海南、广西、云南等地。收载于《中华本草》《全国中草药汇编》《广西药用植物名录》等。大苞水竹叶多分布于长江以南各省（区），尤以西南地区为盛。其根入药，具有较高的药用价值，售价约100元/kg，具有逐水通便、消肿散结的功效，主治水肿，此外还有通经之效，用于治疗慢性肾炎、晚期血吸虫病腹水或其他肝硬变腹水等症[2]。近年来，隨着市场需求量的不断增加，野生大苞水竹叶资源濒临枯竭，生产上难以实现大面积栽培。采用生物技术组织培养技术，可以有效快速地提高大苞水竹叶种苗的繁殖速度和质量，满足大苞水竹叶的市场需求，也可为壮药痰火草资源可持续开发利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料和基本培养条件

本试验所需材料采集自广西壮族自治区药用植物园引种繁育圃内引种栽培的生长健壮、无病虫害的优良大苞水竹叶植株，选取其侧芽作为外植体进行诱导，先将大苞水竹叶侧芽表面洗净去污，用浓度为75%的乙醇灭菌30～45 s，然后用无菌水冲洗1～3次，放入灭菌剂灭菌，再用无菌水冲洗2～5次，然后用无菌滤纸将侧芽表层的水分吸干，最后将测芽置于基本培养基上进行诱导培养，在平均光照度2 000 lx下培养，光照时间12 h/d，温度（24±2） ℃。

1.2 适宜灭菌条件的筛选

设计2组消毒试验。第1组设计不同消毒剂种类：0.1% HgCl2 10 min，2% NaClO 20 min，50%的84消毒液20 min，2% H2O2 20 min，从中筛选最适合的消毒剂；第2组设计不同的消毒时间：5、6、7、8、9、10 min。所有的试验都是在接种后 15 d 对试验对象的污染率、成活率进行统计。

1.3 不定芽诱导分化条件的筛选

本试验基于MS、B5、N6培养基，添加NAA、IAA、6-BA这3种不同类型激素，并开展NAA浓度（0.5、1.0、1.5 mg/L）、KT浓度（0.1、0.2、0.4 mg/L）、6-BA浓度（1.0、1.5、2.0 mg/L）的正交设计（表1），研究不同激素组合对大苞水竹叶不定芽诱导的影响，每个处理10瓶，每瓶4个外植体，20 d后记录外植体的诱导情况，比较不同组合诱导不定芽能力的差异。

1.4 不定芽繁殖条件的筛选

在MS为基本培养基的基础上，以6-BA、IAA为生长调节激素，考察大苞水竹叶不定芽繁殖情况。通过6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）、IAA（0.2、0.4、0.6 mg/L）2种激素浓度组合试验，对大苞水竹叶的繁殖培养基进行优化，每个处理10瓶，每瓶4个单芽，20 d后测定试管苗生长情况和芽增殖倍数[芽增殖倍数=（20 d后芽数-接种时芽数）/接种时芽数]，以芽增值倍数为主要考察指标来优化繁殖培养基。

1.5 生根条件的筛选

为了研究大苞水竹叶无菌苗生根壮苗的最适合培养基，以MS为基本培养基，对IBA浓度（1.0、2.0 mg/L）、活性炭（AC）浓度（0.5、1.0、1.5 mg/L）进行组合试验，对大苞水竹叶的繁殖培养基进行优化，将生长健壮、高2～3 cm的无根苗接种于4种不同处理的生根培养基上，每个处理10瓶，每瓶8个单芽，培养40 d后统计结果，计算生根率与生根数平均值，相关公式如下：

生根率=（生根数/接种总数）×100%；endprint

生根数平均值=（总生根数/接种总数）×100%。

1.6 炼苗及移栽

当生根培养的大苞水竹叶瓶苗长至3～5 cm高、有3张以上叶片和3～5条根时，即可出瓶移栽。挑选生长旺盛、根系发达的试管苗，为使无菌苗移栽后适应自然环境，出瓶前在实验室散射光下炼苗2 d，转移至走廊处炼苗3 d，其间需向瓶内植株洒水以保持瓶内水分充足，将生根试管苗小心地从培养瓶中取出，用水洗净根部残留的培养基，单株栽入基质（V木屑 ∶V草炭土=3 ∶1），置于室内1周，2 d浇水1次，保持土质80%左右的湿润度，温度18～25 ℃，木屑保水性、透气性都很好。30 d后统计不同基质中组培苗的成活率。

2 结果与分析

2.1 灭菌条件的选择

如表2所示，0.1% HgCl2具有较好的消毒效果，外植体消毒成功率达到60%；NaClO、84消毒液、H2O2消毒效果均不够理想，消毒不彻底，污染率高。由表3知：使用0.1% HgCl2消毒 8 min成功率最高，达到90%， 低于8 min时污染率高，

高于8 min时，污染率虽然降低，但是死亡率不断升高。因此，综合比较可知，较好的消毒剂为0.1% HgCl2，较好的消毒时间为8～10 min。

2.2 不定芽的诱导条件选择

将顶芽分化获得的不定芽进行快速繁殖培养，外植体接种到MS、B5、N6培养基中，在培养温度为23～26 ℃、光照度为1 400～2 000 lx、光照时间为10～12 h/d的条件下培养15 d，侧芽分化后获得不定芽。B5培养基中侧芽分化成愈伤褐化，N6培养基中侧芽分化慢，系数低；MS培养基中含0.1～0.4 mg/L KT、1.0～2.0 mg/L 6-BA、1.0～2.0 mg/L NAA、20～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L琼脂，培养基的pH值为58。观察发现，随着培养基中6-BA、NAA浓度的增加，大苞水竹叶不定芽数均增加。由表4可以看出，最优组合是A3B2C1，即在培养基中添加0.4 mg/L KT、1.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的不定芽繁殖效果最好，平均分化出11个不定芽。组培苗诱导的各个阶段效果见图1。

2.3 不定芽壮苗条件选择

将“2.2” 节中得到的试管苗不定芽置于MS壮苗培养基中，在培养温度23～26 ℃、光照度1 400～2 000 lx、光照时间10～12 h/d的条件下培养40 d，得到健壮植株，其中MS壮苗培养基中含0.5～1.5 mg/L 6-BA、0.2～0.6 mg/L IAA、20～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L琼脂，培养基的pH值为5.8，观察发现，培养基中添加1.0 mg/L 6-BA和0.6 mg/L IAA时壮苗效果最好，株高达到5.37 cm（表5）。

2.4 健壮植株生根培养条件选择

将得到的健壮植株置于生根培养基中，在培养温度23～26 ℃、光照度1 400～2 000 lx、光照时间10～12 h/d的条件下培养40 d，得到带根的完整植株，其中MS生根培养基中含0.5～1.5 mg/L IAA、1.0～2.0 mg/L IBA、25～30 g/L蔗糖和3.8～4.8 g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。观察发现，随着培养基中IAA浓度增加，组培苗的生根率也提高；培养基中添加2.0 mg/L IBA和1.0 mg/L IAA的生根效果最好，生根率达93.1%，平均根长达到4.49 cm（表6）。

2.5 试管苗移栽条件

经生根培养后的大苞水竹叶，挑选生长旺盛、根系发达的试管苗移入常温室内放置，拧松盖子，2 d后掀开盖子让大苞水竹叶幼苗与空气完全接触，其间需向瓶内的植株洒水以保持瓶内的水分充足。3 d后从瓶内取出幼苗，洗净根部的培养基，移栽于消过毒的泥炭、泥炭+蛭石（体积比3 ∶1）、泥炭+黄沙（體积比3 ∶1）3种不同基质上，适度遮阴，并保持一定的湿度。30 d后统计生根率和生长率。由表7可以看出，不同基质成活率的高低顺序为泥炭+黄沙（体积比3 ∶1）>泥炭+蛭石（体积比3 ∶1）>泥炭。因此，试管苗移栽最好的基质为泥炭+黄沙（体积比3 ∶1），移栽30 d成活率为84%。

3 讨论

鸭跖草科植物均为草本，主要分布于热带，少数种产于亚热带、温带地区，中国产13属49种，多分布于长江以南各省（区），尤以西南地区为盛。目前对鸭跖草科植物的研究开展的较少，仅有关于其生物学特性[1-2]、分布与分类[3]、种植栽培、病虫害[4]、化学成分[5-7]、药理作用的报道[8]，未见有关组培的报道。本研究采用大苞水竹叶侧芽为外植体，以芽繁芽，未经过愈伤组织阶段，对侧芽分化及植株再生方法进行探讨，建立了大苞水竹叶的离体再生体系，有利于保持大苞水竹叶的遗传稳定性，不但满足了工厂化生产的需求，还具有实际意义。

植物生长调节剂是培养基中的关键物质，能以极微小的量影响植物的细胞分化、分裂和发育，在植物离体培养中起重要调节作用[9]。当细胞分裂素/生长素的比值合适时，能诱导芽的形成和促进芽的生长。6-BA是重要的细胞分裂素，能促进细胞分裂、非分化组织分化、侧芽生长等；NAA是植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大、诱导形成不定根等作用；IAA是植物生长素，能促进细胞分裂与细胞生长，诱导形成不定根[10-11]。多种激素组合能更有效地促进植物的生长，因此在MS培养基中加入6-BA、IAA配合使用，对大苞水竹叶生长均具有较大的影响。本研究得出，大苞水竹叶增殖的最适培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.6 mg/L IAA，在此培养基上增值率为6.5且芽苗翠绿粗壮。试验中不定芽生根率达93.1%，移栽成活率为98%，生产出的种苗，既可满足人们对大苞水竹叶的用途需求，又可保护珍稀濒危种质资源，同时还为丰富我国园林植物种类提供保障。本研究为著名壮药植物大苞水竹叶的保护和可持续开发利用开辟了一条新的途径，同时可为同属其他物种的组织培养研究提供借鉴。

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