转运蛋白在背根神经节参与调控神经病理性疼痛的机制研究*

马冰洁 刘晓明 马 柯

（上海交通大学医学院附属新华医院疼痛科，上海200092）

•论 著•

转运蛋白在背根神经节参与调控神经病理性疼痛的机制研究*

马冰洁 刘晓明 马 柯△

（上海交通大学医学院附属新华医院疼痛科，上海200092）

目的：探讨背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)转运蛋白(translocator protein, TSPO)对神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)的影响及可能的作用机制。方法：雄性SD大鼠随机分为3组：假手术组(Sham组)、对照组(SNI组)和给药组(Ro组)。采用von-Frey丝测量大鼠50%机械刺激缩足阈值 (paw withdrawal threshold, PWT)，在术后第7天、14天取DRG，采用免疫荧光及蛋白印迹技术检测TSPO、脑源性神经营养因子BDNF和蛋白激酶p-ERK。结果：①相较Sham组，SNI组DRG表达TSPO阳性细胞升高(D7:P＜ 0.05, D14:P＜ 0.01)，TSPO在DRG与肽能和非肽能中小神经元、有髓大神经元和卫星胶质细胞均有共定位。②SNI组大鼠PWT术后相较Sham组明显降低 (P＜ 0.01)；Ro组大鼠鞘内注射Ro5-4864后 PWT升高(D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05)、BDNF下调(P＜ 0.05)、p-ERK1(P＜ 0.01)和p-ERK2 (D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05)下降。结论：鞘内注射TSPO配体 Ro5-4864可缓解NP大鼠的痛觉超敏，其在DRG的机制可能与抑制p-ERK、BDNF的活化有关。

神经病理性疼痛；转运蛋白；脑源性神经营养因子

神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是由躯体感觉神经系统的损伤和疾病而直接造成的疼痛。以自发性疼痛、痛觉过敏、痛觉超敏为主要临床特征，不仅疼痛程度剧烈，且严重影响患者的生活质量。对于NP，传统的镇痛药物如非甾体、阿片类药物治疗效果差，其他如抗惊厥/癫痫以及抗抑郁/焦虑等药物也都不能达到满意疗效[1]。

转运蛋白(translocator protein, TSPO)主要定位于线粒体外膜[2]，在甾体合成相关的组织中高度表达，包括大脑和脊髓。在类固醇合成的细胞中，TSPO介导胆固醇从线粒体外膜向内膜转移，是类固醇激素及神经甾体合成的限速步骤[3]。最近，TSPO被认为在一些神经疾病中起关键作用，如脑损伤、阿尔茨海默病、炎症性疼痛和NP。在神经系统中，TSPO在神经元和胶质细胞中均有表达，不过其作用尚不清楚。我们以往的研究表明，NP中脊髓水平TSPO表达增加，其可能通过抑制依赖CXCL1-CXCR2的星形胶质细胞-神经元信号系统和中枢敏化，减轻痛敏[4]。不过，TSPO在其他部位的作用机制尚未探究。因此，本实验拟采用保留性坐骨神经损伤模型(spared nerve injury, SNI)观察术后DRG中TSPO的表达变化规律，并观察鞘内给予TSPO受体激动剂对大鼠痛觉超敏的影响，旨在为治疗神经病理性疼痛提供理论依据。

方 法

1. 实验动物及分组

成年雄性SD大鼠，体重180～200 g，由新华医院动物房提供。动物用随机数字表法随机分为三组，包括假手术组（Sham组）：暴露但不结扎坐骨神经，术后第三天鞘内注射溶剂；对照组（SNI组）：行SNI术，术后第三天鞘内注射溶剂；给药组（Ro组）：行SNI术，术后第三天鞘内注射TSPO受体激动剂Ro5-4864。每组均在术后第7天和术后第14天处死动物并取材，每个时间点6只大鼠，其中3只用于蛋白印迹检测，3只用于免疫荧光检测。

2. 主要试剂

TSPO受体激动剂Ro5-4864 (7-Chloro-5-(4-chlorophenyl)-1,3-Dihydro-1-Methyl-2H-1,4-Benzodiazepin-2-one)用二甲基亚砜（DMSO）溶解，Ro5-4864和DMSO均购买于美国Sigma Aldrich 公司。Ro5-4864溶于20%DMSO，Ro组在SNI术后第三天鞘内注射 2 µg（浓度为 0.5 µg/µl, 体积 4 µl），SNI组和Sham组给予同等剂量的20%DMSO。

3. SNI模型的建立

根据文献中描述的方法[5],对大鼠采用10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉，将大鼠右侧卧位，四肢固定于手术台板上，在大鼠左侧后肢上缘切开皮肤并钝性分离肌肉，暴露坐骨神经主干及其分支：胫神经、腓总神经和腓肠神经。用5-0丝线紧紧结扎并剪断胫神经和腓总神经，剪去2 ～4 mm残余神经末端，保留腓肠神经。操作过程中尽量避免腓肠神经受到损伤和牵拉。依次缝合肌肉和皮肤。Sham组仅暴露坐骨神经及其三个分支，不给予结扎和剪断，其余步骤同SNI模型。

4. 行为学分析

采用Chaplan等人报道的Up-Down方法[6]，在术前(D0)、术后第三天(D3)、术后第7天(D7)、术后第14天(D14)早晨9:00测定大鼠的50%机械刺激缩足阈值(paw withdrawal threshold, PWT)。将大鼠置于棕色不透光塑料笼架(20 cm×15 cm×15 cm)内约30 min，待大鼠安静后，采用Von Frey纤维丝根据折力大小对大鼠左后肢足底部外侧皮肤进行机械性刺激，每次刺激持续6～8 s。首先用力度为2.0 g的纤维丝开始测试，测试时纤维丝微弯曲，在大鼠足底保持6～8 s，若出现快速缩足或舔足行为记为阳性反应。若出现阳性反应，则选用相邻刺激强度递减的纤维丝继续刺激；反之，若出现阴性反应，则选择相邻递增的纤维丝给予刺激，如此反复。每次刺激间隔时间为30 s左右。根据Chaplan等人描述的方法[6]计算50%PWT。

5. 蛋白免疫印迹分析

腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg深度麻醉后，放血处死大鼠，咬骨钳分离椎板后，迅速取出L4、L5DRG，液氮速冻后放入-80℃保存。各样本称取等量组织标本后，按比例加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，然后进行组织匀浆，12000 r/min 4℃离心15 min，取上清，BCA法测定蛋白浓度。将40 µg/well总蛋白加入SDS上样缓冲液，100℃变性10 min，采用12%十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate -poly-acrylamide gel electrop horesis, SDS-PAGE)，蛋白转至PVDF膜，转膜时恒流300 mA，时间70 min。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，抗TSPO抗体（兔源，1:1 000, Santa Cruz Biotechnology, 美国），抗BDNF抗体（兔源，1:1 000, Sigma Aldrich, 美国），抗p-ERK抗体（兔源，1:1 000, 将 Cell Signaling Technology, 美国），抗ACTIN抗体（小鼠源，1:1 000，碧云天，中国）4℃摇床孵育过夜。TBST缓冲液冲洗10 min×3次，辣根过氧化物酶标二抗室温孵育1 h，TBST缓冲液冲洗10 min×3次，ECL显色曝光。目标蛋白与内参的灰度比值表示目的蛋白的相对表达量。

6.免疫荧光检测

分别于SNI术后第7天和第14天取材，腹腔注射10%水合氯醛400 mg/kg深度麻醉后，开胸经左心室注射磷酸缓冲液（PBS）至流出液无色，灌注4%多聚甲醛固定组织后，取出L4、L5DRG，采用4%多聚甲醛后固定12 h，30%蔗糖脱水12 h至沉底，包埋制作冰冻切片，厚度10µm。切片经10%驴血清加0.3% Triton X-100封闭破膜1 h，抗TSPO抗体（兔源，1:100, Santa Cruz Biotechnology,美国），抗NF200抗体（小鼠源, 1:1 000, Sigma Aldrich, 美国），抗CGRP抗体（小鼠源, 1:1 000，Sigma Aldrich, 美国），IB4（1:200, invitrogen, 美国）4℃ 孵育过夜。PBS缓冲液冲洗10 min×3次，荧光标记二抗室温孵育1 h，PBS缓冲液冲洗10 min×3次，滴加抗荧光淬灭剂 （购自碧云天，中国），封片，荧光显微镜下扫描拍照。

7. 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差(±SD)表示。采用重复测量的方差分析比较各组机械痛阈值；TSPO,BDNF, p-ERK蛋白表达水平同一时间点组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。为了分析免疫荧光，我们从每只大鼠DRG中随机选取6片，每组每个时间点三只动物。DRG上矩形内的图像用强度值来分析，Image J进行计算。每片的背景强度均被扣除。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

1. SNI导致NP并且诱导DRG中TSPO表达上调

行为学测量分别于SNI术前(D0)、术后第3天(D3)、第7天(D7)和第14天(D14)进行。SNI组在术后第3天直至本实验观察的术后第14天，其PWT显著降低，与sham组相比具有统计学意义(P＜ 0.01, 见图1A)。我们用免疫荧光的方法检测DRG中TSPO的表达，结果表明，sham组大鼠DRG中TSPO表达量较低，SNI术后第7天、第14天 TSPO表达量均上调（见图1B）,与蛋白印迹结果一致（见图3B）。

为了检测TSPO的细胞定位，我们做了TSPO和不同神经细胞标志物的共染，结果表明，TSPO与NF200、IB4、CGRP和S-100均有共定位，其中在NF200（大神经元）中分布最多，占47%（见图2）。

2. 鞘内注射TSPO受体激动剂Ro5-4864减轻NP并影响DRG中TSPO的表达

行为学表明，鞘内注射Ro5-4864后，Ro组PWT在术后第7天、第14天均上升，与SNI组相比具有统计学意义 (D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05, 见图3A)。蛋白印迹结果显示，在术后第7天 Ro5-4864显著增加了TSPO的表达量(P＜ 0.01)；同时在术后第14天抑制了TSPO的表达(P＜ 0.05, 见图3B)。

3. 鞘内注射Ro5-4864对DRG中BDNF、p-ERK的影响

图1 SNI引起大鼠触诱发痛并上调DRG中TSPO的表达A：SNI术后大鼠PWT的变化，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；B：SNI术后DRG中TSPO的表达变化Fig.1 Spared nerve injury (SNI) induces mechanical allodynia and translocator protein (TSPO) upregulation in the DRGA: Paw mechanical withdraw threshold(PWT) after SNI. *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, compared with sham group. B: TSPO expression in DRG after SNI.

根据蛋白印迹结果，神经损伤后BDNF表达水平较sham组升高(D7:P＜ 0.01)，鞘内注射Ro5-4864后，其表达下降(P＜ 0.05, 见图4A)。同样地，与Sham组相比，SNI术后上调p-ERK1 (P＜0.01)、p-ERK2 (D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05)，鞘内注射 Ro5-4864后也降低了 p-ERK1 (P＜ 0.01)和p-ERK2 (D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05)的表达水平（见图4B），与SNI组相比有统计学意义。

讨 论

本研究发现SNI能引起大鼠DRG中TSPO、BDNF、p-ERK的表达升高，通过鞘内注射TSPO受体激动剂可以降低大鼠的痛觉超敏现象，并能减少DRG中BDNF和P-ERK的表达。

图2 DRG中TSPO的分布免疫荧光共染表明TSPO和NF200（A）、IB4（B）、CGRP（C）和S-100（D）均有共定位。E为TSPO在DRG中各细胞分布的比例。Fig.2 Distribution of TSPO in the DRG(A-D) Double staining of immunofluorescence shows that TSPO is colocalized with NF200, IB4, CGRP and S-100.(E) Percentage of TSPO distribution in the DRG.

图3 鞘内注射Ro5-4864减轻大鼠触诱发痛并调节DRG中TSPO的表达A：鞘内注射Ro5-4864对SNI大鼠PWT的影响；B：鞘内注射Ro5-4864后 DRG中TSPO的表达变化。箭头表示给药时间。与Sham 组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；与 SNI组比较，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01.Fig.3 Intrathecal injection of Ro5-4864 alleviates mechanical allodynia and regulates TSPO expression in the DRGA: Effects of intrathecal injection of Ro5-4864 on PWT; B:TSPO expression in the DRG after intrathecal injection of Ro5-4864. Arrow indicates the time of intrathecal injection. *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01compared with sham group; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01 compared with SNI group.

图4 各组大鼠DRG中BDNF、p-ERK表达量的变化A：鞘内注射Ro5-4864后DRG中BDNF的表达变化；B：鞘内注射Ro5-4864对DRG中p-ERK的影响。与Sham组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；与 SNI组比较，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01.Fig.4 Changes of BDNF and p-ERK expression in the DRG in all groupsA: BDNF expression in DRG after intrathecal injection of Ro5-4864; B: Effects of intrathecal injection of Ro5-4864 on phospho–extracellular signal-regulated kinase (p-ERK) activation in the DRG. *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01compared with sham group; #P ＜ 0.05, ##P ＜ 0.01 compared with SNI group.

在以往的研究中，TSPO受体激动剂被证明在治疗神经精神类疾病和疼痛中有效[7,8]，我们的实验结果也表明，鞘内注射TSPO受体激动剂后，明显减轻了NP大鼠的痛觉超敏现象。本实验采取鞘内给药的方法，故TSPO受体激动剂可能在脊髓和DRG中均发挥作用。在脊髓水平，TSPO受体激动剂可能通过调节类固醇激素的合成抑制NP[7]；许多学者认为TSPO的表达上调是机体在应激状态下的内源性保护反应，神经损伤后脊髓背角TSPO表达增高，当神经恢复正常时，TSPO表达也降至正常水平[7]；我们以往的研究也表明，在脊髓中TSPO受体激动剂抑制星形胶质细胞活化，进一步抑制依赖CXCL1-CXCR2的星形胶质细胞-神经元信号系统和中枢敏化，减轻NP中的痛敏[4]。 生理状态下，DRG中TSPO的表达水平不高，外周神经损伤后其表达上调。本实验中，当外周神经损伤后，DRG中TSPO表达水平上升，在给予TSPO受体激动剂后，随着大鼠机械痛阈的上升，TSPO表达水平在术后第14天较对照组下调。在类固醇合成的细胞中，TSPO介导胆固醇从线粒体外膜向线粒体内膜转移，是类固醇激素及神经甾体合成的限速步骤[3]，许多类固醇激素具有镇痛作用。例如，黄体酮代谢为5α-DHT和3α，5α-THP，在DRG中感觉神经元的兴奋性由3α，5α-THP的浓度调控，3α，5α-THP可通过T型钙通道和GABAA产生镇痛作用[9]。因此，DRG中TSPO可能通过调控类固醇激素来产生镇痛作用。神经损伤后TSPO表达上调，给予Ro5-4864可有助于DRG中神经元存活和神经突的生长、促进外周神经再生[10]，但其是否和NP有关尚有待进一步研究。

在NP的发展过程中，DRG并非仅仅是在生理功能上被动支持连接外周和中枢神经系统，而是深深参与到NP的外周过程。外周神经损伤后，DRG释放一系列细胞因子：趋化素、生长因子、白介素、干扰素、TNF-α，早期、晚期基因发生改变，ATP产生变化，钠、钾、钙离子通道和离子流改变，导致DRG神经元超兴奋；卫星胶质细胞的激活可进一步影响脊髓背角神经元，导致中枢敏化和慢性疼痛[11]。外周神经损伤后，DRG中BDNF mRNA和蛋白水平上升，在术后第一天其mRNA水平最高，随后下降，至术后第14天，依然高于正常水平[12]。BDNF在DRG神经元中合成，顺行运输到脊髓的中枢神经末梢。在脊髓背角，BDNF通过调节神经递质促进中枢敏化导致NP[13]；另一方面，BDNF可激活星形胶质细胞和小胶质细胞调节NP[14]。直接注射外源性BDNF可以引起机械触诱发痛。神经损伤后DRG中增加的BDNF可能通过TrR B受体降低BK通道活性，使初级传入神经元超兴奋，增加脊髓的伤害性信息传入，导致NP[15]。TSPO可以调节类固醇激素的合成，在糖尿病周围神经病变大鼠中，给予TSPO受体激动剂可提高烯醇酮(PREG)、黄体酮(PROG)等类固醇激素的水平，起到神经保护的作用[16]。大脑损伤后BDNF水平上升，经过类固醇激素黄体酮(PROG)治疗，其Pro-BDNF和成熟BDNF水平均下降[17]；也有研究发现，脊髓损伤后BDNF水平下降，给予PROG治疗后BDNF水平上升[18]。在我们的研究中，SNI术后BDNF水平上升，鞘内注射TSPO受体激动剂后，其水平降低。因此，我们推测，在DRG 中，TSPO受体激动剂可能通过调节类固醇激素的合成来平衡BDNF的水平。在外周炎症和NP模型中，ERK活化是DRG神经元细胞体内BDNF上调的原因[19]。而且，在NP模型中，DRG内ERK磷酸化导致受损神经元中NPY水平上调，DRG中的NPY可以改变神经元的兴奋性，调节疼痛[19]。在CCD模型中，CCD通过活化ERK抑制A型快速失活钾通道，引起DRG神经元兴奋[20]。在本实验中，给予TSPO受体激动剂后，p-ERK和BDNF水平下调，TSPO可能通过其下调进一步影响NP。

总之，TSPO参与NP的调控，TSPO受体激动剂或许为治疗NP提供一种新的思路。

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THE INVOLVEMENT OF TRANSLOCATOR PROTEIN IN THE DORSAL ROOT GANGLION IN NEUROPATHIC PAIN *

MA Bing-Jie1, LIU Xiao-Ming1, MA Ke1△
(1Department of Pain Management, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200092, China)

Objective:To investigate the role of translocator protein (TSPO) in the dorsal root ganglion (DRG)in neuropathic pain and to explore the possible mechanism.Methods:All male Sprague-Dawley rats were randomly assigned into 3 groups: the Sham group, the control group (SNI group) and the treatment group (Ro group). Vonfrey fi laments were used to measure the 50% paw withdrawal thresholds (PWT). The expression of TSPO, BDNF and p-ERK in the DRG was detected by western blot and immuno fl uorescence.Results:① Compared with the Sham group, the expression of TSPO was increased in the SNI group (D7:P＜ 0.05,D14:P＜ 0.01). The TSPO signals were colocalized with IB4, CGRP, NF-200 positive neurons and S-100 positive glial cells. ② The PWT of SNI rats was signi fi cantly decreased compared with the sham group (P＜0.01), which was reversed by intrathecal injection of ligand of TSPO (Ro5-4864) (D7:P＜ 0.01, D14:P＜0.05). Furthermore, the expression of BDNF (P＜ 0.05), p-ERK1 (P＜ 0.01) and p-ERK2 (D7:P＜ 0.01, D14:P＜ 0.05) was declined in the Ro group.Conclusion:A single intrathecal injection of TSPO agonist Ro5-4864 attenuated mechanical allodynia in neuropathic pain. The mechanisms may be partly attributed to the inhibition of p-ERK and BDNF expression in the DRG.

Neuropathic pain; TSPO; BDNF

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.06.004

国家自然基金（81371246）；江苏省博士后科研基金（1302019B）

△通讯作者 marke72@163.com