垫状卷柏总黄酮的 抗氧化和抗肿瘤活性

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(药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室,四川抗菌素工业研究所,成都大学，四川成都 610052)

垫状卷柏总黄酮的 抗氧化和抗肿瘤活性

郑瑞凤,刘嵬,梁立,杨晨,颜军,苟小军,何钢*

(药食同源植物资源开发四川省高校重点实验室,四川抗菌素工业研究所,成都大学，四川成都 610052)

目的：研究垫状卷柏总黄酮的抗氧化能力,以及对人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人前列腺癌细胞PC-3M的生长抑制作用。方法：采用Fenton法、邻苯三酚自氧化法、DPPH法和还原力测定法评价垫状卷柏总黄酮的体外抗氧化能力。CCK-8法检测垫状卷柏总黄酮的抗肿瘤细胞增殖活性。结果：在总黄酮质量浓度为20～100 μg/mL之间,垫状卷柏总黄酮对羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除率随总黄酮质量浓度升高而增高,半数清除率EC50分别为111.86、89.24、26.51 μg/mL;对Hela、PC-3M和MDA-MB-231细胞的抑制作用在总黄酮质量浓度为6.59～79.02 μg/mL范围内均呈剂量依赖性,作用时间为72 h的抑制率高于48 h的抑制率。结论：垫状卷柏总黄酮抗氧化活性作用能力强,对Hela、PC-3M和MDA-MB-231细胞具有显著的增殖抑制作用。

垫状卷柏,总黄酮,抗氧化,肿瘤细胞,生长抑制

卷柏(Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring)为蕨类植物门卷柏科卷柏属植物,分布广泛,我国约有60～70种[1],四川约有21种[2],常作为药用的有6种。《中华人民共和国药典》2015年版收载了卷柏科植物卷柏或垫状卷柏。中医学上认为卷柏具有活血通经之功效,用于经闭痛经,跌扑损伤,症瘕痞块;炒炭后可化瘀止血,用于吐血、便血、崩漏、脱肛[3]。卷柏含有丰富的双黄酮类生物活性物质,具有抗氧化[4-5]、抗炎[6]、抑菌[7]、抗病毒[8]、抗肿瘤[9-11]、舒张血管[12]等多种药理活性。

已有研究表明卷柏总黄酮对结肠癌HT-29细胞,肝癌Bel-7402细胞,人肝癌HepG2细胞,肺癌A549细胞具有显著的抑制作用[9-11]。而卷柏总黄酮对乳腺癌和前列腺癌细胞的活性研究较少。研究垫状卷柏总黄酮对前列腺癌PC-3M细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞的抑制活性,以及采用体外抗氧化模型评价体外抗氧化活性,为垫状卷柏的进一步开发利用提供依据,尤其在抗氧化剂和抗癌药物的筛选提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

垫状卷柏 成都钟氏虫草行;PC-3M、Hela细胞 英国利物浦大学柯有强教授实验室赠送;MDA-MB-231细胞 中国科学院基础医学研究院细胞库;芦丁标准品(纯度≥99%) 中国药品生物制品检定所;邻菲罗啉、邻苯三酚、硫酸亚铁、双氧水、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、噻唑蓝(CCK)、二甲基亚砜(DMSO)、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、无水乙醇 均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂;PBS缓冲液(pH7.4)、DMEM培养液、RPMI1640培养液 美国Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、0.05%胰酶-EDTA消化液(trypsin-ethylene diamine tetraacetie acid,EDTA)、青霉素、链霉素混合液(×100) 美国Gibco公司;细胞培养瓶、96孔板、15 mL离心管 美国Corning公司。

7200型可见光分光光度仪 尤尼柯(上海)仪器有限公司;旋转蒸发仪 巩义市英峪予华仪器厂;电子天平JT202N 上海越平科学仪器有限公司;台式离心机 上海安亭科学仪器厂;KQ3200超声波清洗器 北京沪光学实验仪器有限公司;微型植物式样粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司;全自动酶标仪(EL×800) Bioteck Instruments Inc.;CO2细胞培养箱 上海跃进医疗器械有限公司;超净工作台 苏州集团苏州安泰空气技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 垫状卷柏总黄酮的制备 将干燥至恒重的垫状卷柏全草,粉碎过40目筛,储存于干燥器中备用。按照实验室前期研究方法,准确称取200 g垫状卷柏干燥粉末,按料液比(g∶mL=1∶20),用70%乙醇浸提24 h,超声辅助提取30 min,真空抽滤,滤渣重复上述操作提取两次,合并滤液,减压旋蒸除去乙醇,冷冻干燥得垫状卷柏总黄酮粉末。以芦丁为标准品,经硝酸铝显色法[12],检测波长为512 nm,测定垫状卷柏总黄酮质量浓度。

1.2.2 清除DPPH自由基能力的测定 DPPH(二苯代苦味酰基自由基)是一种比较稳定的人工合成自由基,现已广泛的用于提取物[13]、酚类物质[14]、多糖类化合物[15]或其它物质[16]的抗氧化能力评价。根据对DPPH自由基的清除能力的原理方法[17-18]评价垫状卷柏总黄酮的体外抗氧化活性。样品用70%乙醇溶液配制成不同浓度溶液,取1.0 mL样品溶液、2.0 mL DPPH乙醇溶液和1.0 mL无水乙醇混合反应,置于暗处30 min,于波长517 nm处测定吸光度。用样品乙醇溶液作为样品颜色空白参比,无水乙醇为空白对照。按照同样方法以同浓度VC做阳性对照。

清除率(%)=A空白对照-(A样品-A颜色对照)/A空白对照×100

1.2.3 清除超氧阴离子自由基能力的测定 采用邻苯三酚自氧化法[19]。于试管中加入5 mL 0.05 mol/L pH8.2的Tris-HCl缓冲液和2 mL蒸馏水,25 ℃水浴20 min后,取出加入不同浓度样品溶液2 mL,并立即加入3 mmol/L 邻苯三酚1 mL(在25 ℃水浴中已预热),立即混匀,在25 ℃水浴中准确反应4 min后,加入10 mmol/L的HCl溶液1 mL终止反应,并于320 nm处测定吸光度。按照同样方法以同浓度VC做阳性对照。

清除率(%)=A不加样品时吸光度-(A样品吸光度-A不加邻苯三酚样品的吸光度)/A不加样品时吸光度×100

1.2.4 清除羟基自由基能力的测定 采用水杨酸法[20],于试管中加入2 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液和2 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液,混匀,再加入2 mL不同浓度样品溶液和0.2 mL 0.3%的H2O2溶液(以不加H2O2作为颜色空白对照,以蒸馏水作为空白对照)于37 ℃反应30 min,以去离子水为参比,然后在510 nm波长下分别测定吸光度A,按照同样方法以同浓度VC做阳性对照。

清除率(%)=A空白对照-(A样品-A颜色对照)/A空白对照×100

1.2.5 垫状卷柏总黄酮还原力的测定 参考文献[21]中的方法,于试管加入不同浓度的样品溶液2.5 mL,pH6.8的磷酸盐缓冲液2.5 mL、1% K3Fe(CN)6溶液2.5 mL,并加蒸馏水至10 mL,混合均匀,混合液于50 ℃保温20 min,再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液,混合后3000 r/min 离心10 min。取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸馏水,加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液,室温放置10 min,测定反应液在700 nm处的吸光度。

1.2.6 细胞培养 Hela人宫颈癌细胞[22]用含10%胎牛血清的培养液,100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素DMEM高糖培养基,在37 ℃、5% CO2培养箱中传代培养;PC-3M前列腺癌细胞[23],MDA-MB-231乳腺癌细胞[24]用含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养基,在37 ℃、5% CO2培养箱中传代培养。

教师的专业化发展始终离不开学校组织的各类培训。本研究对吉林省4所有代表性的应用型本科院校商务英语教师进行了问卷调查，结合我省具体状况，总体分析国内同类高校一般情况，首先向被调查教师解释问卷调查的目的是为了了解院校商务英语教师发展现状，探寻应用型本科院校商务英语教师专业化发展途径，请他们如实客观地回答。共发放问卷 76份，全部回收，有效问卷73份。为了消除被调查者顾虑，调查问卷采取无记名的方式。在问卷调查的基础上还对4所学校的一些教师进行随机访谈。因此，该调查结果有一定代表性。调查结果相对真实而客观，调查的师资情况见表1。

1.2.7 体外抑制肿瘤细胞增殖实验 采用CCK法进行测定[24-25]。取对数生长期的肿瘤细胞Hela、PC-3M、NDA-MB-231细胞接种于96孔板,使每孔细胞约为1×104个/mL,实验组和正常对照组分别加入100 μL细胞悬浮液,空白组加入100 μL培养基,37 ℃,5% CO2条件下预培养24 h。加入不同浓度的样品溶液,每个浓度设置3个复孔,正常对照组和空白组分别加入100 μL培养基。继续在37 ℃,5% CO2条件下培养48、72 h后,吸弃上清后每孔各加入100 μL培养基和10 μL CCK-8试剂,继续在CO2培养箱孵育1 h后取出用酶标仪在490 nm处测定吸光度值。计算对癌细胞的抑制率或细胞活力。

1.3数据处理

所有实验处理重复3次,实验结果均表示为平均值±标准差。采用SPSS 20.0软件进行数据处理,进行单因素方差分析,各组间的差异比较采用LSD法,以p<0.05表示差异显著,p<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1DPPH抗氧化活性

不同浓度的垫状卷柏总黄酮对DPPH的清除率结果见图1。浓度在20～100 μg/mL范围内其清除能力随总黄酮浓度的升高而加强,而浓度增加为200 μg/mL时,清除率增加不明显,并趋于平衡,垫状卷柏和VC的清除率分别为83.42%和94.98%,卷柏总黄酮对DPPH自由基的半数清除率EC50为26.51 μg/mL;通过考察垫状卷柏总黄酮对DPPH自由基的清除,表明垫状卷柏总黄酮有较好的清除能力,可能与总黄酮中的穗花杉双黄酮化合物有关[5],有文献研究报道垫状卷柏双黄酮和穗花杉双黄酮[26]均可浓度依赖性清除DPPH自由基。

图1 垫状卷柏总黄酮对DPPH自由基清除率测定结果Fig.1 Scavenging effects of total flavonoids from selaginella on DPPH free radicals

2.2清除超氧阴离子自由基的能力

超氧阴离子是一类重要的活性氧自由基,可诱导大分子物质产生氧化损伤,因此通过测定对超氧阴离子自由基的清除作用可以评价物质的抗氧化能力大小。不同浓度的垫状卷柏总黄酮清除超氧阴离子的作用如图2所示,在20～100 μg/mL范围内,垫状卷柏总黄酮的清除作用随浓度增加而增强,当浓度为200 μg/mL时,VC和垫状卷柏总黄酮对超氧阴离子自由基的清除率分别为91.75%和62.5%,卷柏总黄酮对超氧阴离子自由基的半数清除率EC50为89.24 μg/mL。

图2 垫状卷柏总黄酮对超氧阴离子 自由基清除率测定结果Fig.2 Scavenging effects of total flavonoids from selaginella on superoxide anion free radical

利用Fenton反应产生具有高反应活性的·OH。如果在体系中含有清除·OH能力的物质,能与水杨酸竞争·OH,使水杨酸捕捉·OH后产生的有色物质生成量减少,该物质在510 nm 处有最大吸收[15]。不同浓度的垫状卷柏总黄酮对羟基自由基的清除作用如图3所示,总黄酮浓度为20～200 μg/mL的范围内,VC和垫状卷柏总黄酮的清除作用随浓度的增加而清除活性增强,两者趋势基本一致,当浓度为200 μg/mL时,VC对羟基自由基的清除率为91.25%,垫状卷柏总黄酮的清除能力为64.67%,半数清除率EC50为111.86 μg/mL。结果表明垫状卷柏总黄酮对羟基自由基的清除能力较强。

图3 垫状卷柏总黄酮对羟基自由基清除率测定结果Fig.3 Scavenging effects of total flavonoids from selaginella on hydroxyl radical

2.4还原力测定

物质还原力的原理揭示了待评价化合物是电子给予体,它可将Fe3+还原成Fe2+,能与Fe3+形成普鲁士蓝,在700 nm 处有最大吸收峰,吸光度越大,抗氧化能力越强。表明物质的还原能力和其抗氧化能力呈正相关性,测定物质的还原能力是测定物质抗氧化能力的重要指标之一。由图4所示,在浓度为200 μg/mL时,垫状卷柏总黄酮和VC的OD值分别为0.913、1.439,表明垫状卷柏总黄酮有较强的还原能力,还原能力随总黄酮浓度增加而增强,通过分析计算垫状卷柏总黄酮的总还原能力与其浓度呈正相关性,得到VC和卷柏总黄酮的相关系数分别为0.99和0.98。

图4 垫状卷柏总黄酮的还原力Fig.4 The reducing power of total flavonoids

2.5对癌细胞生长抑制作用

黄酮类化合物发挥抗肿瘤活性的机制主要是抑制肿瘤细胞增殖[27],促进肿瘤细胞凋亡[28-29]等途径发挥活性作用。垫状卷柏总黄酮对Hela细胞、PC-3M细胞以及MDA-MB231细胞增殖活力均有明显的抑制作用,对不同肿瘤细胞的增殖活力抑制具有差异。如图5所示,垫状卷柏总黄酮对不同癌细胞的抑制作用随浓度的增加而增加,揭示了在6.59～79.02 μg/mL浓度范围内垫状卷柏总黄酮对三种肿瘤细胞的抑制作用是呈剂量依赖作用,并随着作用时间的延长,垫状卷柏总黄酮对肿瘤细胞的抑制作用是逐渐增强的。如图6所示,在6.59～131.7 μg/mL范围内,卷柏总黄酮对Hela细胞、MDA-MB-231细胞的增值抑制结果均是72 h高于48 h的抑制率;对PC-3M细胞的抑制作用是在卷柏总黄酮浓度为6.59～13.17 μg/mL范围内是48 h高于72 h,浓度增加为26.34 μg/mL范围内是72 h的抑制作用强于48 h。垫状卷柏总黄酮对Hela、PC-3M和MD-MDA-231细胞作用48 h的半数抑制率IC50分别为:67.29、150.84、139.55 μg/mL,作用72 h的IC50分别为:28.62、48.60、25.74 μg/mL。

图5 不同浓度的垫状卷柏总黄酮 对肿瘤细胞在72 h的生长抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of total flavones on the growth of three different cancer cells after 72 h 注:*表示与空白对照组相比差异显著(p<0.05); **表示与空白对照组相比差异极显著(p<0.01)。

图6 垫状卷柏总黄酮对肿瘤细胞在48 h 和72 h的生长抑制作用Fig.6 Inhibitory effects of total flavones on the growth of three different cancer cells after 48 h and 72 h

3 结论

本实验以卷柏总黄酮为研究对象,采用体外抗氧化模型评价垫状卷柏总黄酮抗氧化能力作用。当总黄酮浓度为200 μg/mL,清除羟基自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除率分别为64.67%、62.5%、83.42%;而卷柏总黄酮对Fe3+还原能力强,当浓度为200 μg/mL,吸光度值为0.913。结果表明卷柏总黄酮对羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基均有一定的清除能力,并在一定浓度范围内总黄酮浓度与清除自由基的能力呈正相关。垫状卷柏总黄酮表现出较强的抗氧化能力,可能与穗花衫双黄酮、罗波斯塔双黄酮、罗波斯塔-4-甲醚双黄酮3种活性成分有关,其作用机制与调节黄嘌呤氧化酶[30-31]、脂质氧化酶[32]、环氧化酶Ⅱ[33]活性有关。

同时,通过对抗肿瘤细胞的增殖作用研究,表明垫状卷柏总黄酮对Hela、PC-3M、MDA-MB-231细胞均表现出较强的增殖抑制活性。随着垫状卷柏总黄酮的质量浓度增加,作用时间延长细胞抑制作用增强,垫状卷柏总黄酮作用72 h时的抑制能力高于作用时间为48 h。当垫状卷柏总黄酮浓度为131.7 μg/mL时,作用时间48 h时对Hela、PC-3M和MD-MDA-231细胞的抑制率分别为:74.95%、43.83%、61.35%,IC50分别为:67.29、150.84、139.55 μg/mL;作用时间72 h时对Hela、PC-3M和MD-MDA-231细胞的抑制率分别为:81.81%、70.49%、73.38%,IC50分别为:28.62、48.60、25.74 μg/mL。卷柏总黄酮对PC-3M细胞的增殖抑制作用,可能与卷柏双黄酮化合物能够下调环氧化酶-2活性有关。同时,本实验对垫状卷柏总黄酮对PC-3M、MDA-MB231、Hela细胞的增殖作用研究中,发现了许多关于肿瘤细胞凋亡的现象,未对其细胞诱导凋亡量化,有待今后实验进一步的研究探讨。下一步,我们将通过分离纯化等技术研究卷柏总黄酮的有效成分,为卷柏总黄酮抗氧化作用和抗癌作用提供理论依据。

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AntioxidantandantiproliferativeactivitiesoftotalflavonoidsextractedfromSelaginellapulvinata(Hook,etGrev.)Maxim

ZHENGRui-feng,LIUWei,LIANGLi,YANGChen,YANJun,GOUXiao-Jun,HEGang*

(Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development of Sichuan Education Department, Sichuan Industrial Institute of Antibiotics,Chengdu University,Chengdu 610052,China)

Objective:To explore the antioxidant activity ofSelaginellapulvinata(Hook,et Grev.)Maxim of total flavone and its growth inhibitory effect on HeLla、PC-3M and MDA-MB231 cells. Methods:Fenton reaction,pyrogallol auto-oxidation and DPPH radical-scavenging systems were used for antioxidant evaluation of total flavonoidsinvitro. The reducing power was evaluated by potassium ferricyanide assay. Growth inhibitory effect of total flavonoids on Hela,PC-3M and MDA-MB231 cells was assessed by CCK-8 assay. Results:The scavenging effects of the total flavonoids on the hydroxyl,superoxide anion and DPPH free radicals increased as the total flavonoids concentration increased within 20～100 μg/mL. The EC50of total flavonoids in scavenging hydroxyl,superoxide anion and DPPH free radicals were 111.86,89.24,26.51 μg/mL,respectively. The growth of HeLa,PC-3M and MDA-MB231 cells was remarkably inhibited by total flavonoids in a dose-dependent manner within the conservation of total flavonoids of 6.59～79.02 μg/mL. The inhibiting Hela,PC-3m and MDA-MB231 cells growth in 72 h was higher than in 48 h. Conclusion:Total flavonoids ofSelaginellapulvinata(Hook,et Grev.)Maxim shows strong antioxidant activity and good inhibitory effect against the growth of Hela,PC-3m and MDA-MB231 cells.

SelaginellapulvinatamMaxim;total flavorne;antioxidant;tumor cells;growth inhibition

2017-03-29

郑瑞凤(1992-),女,在读硕士研究生,研究方向:药物分析,E-mail:zrfblue@163.com。

*

何钢(1982-),男,博士,副教授,研究方向:微生物与生化药学,E-mail:hegang@cdu.edu.cn。

四川省科技厅应用基础项目(2015JY0117);四川省教育厅基础项目(17ZA0089);四川省高校重点实验室项目(TRCWYXFZCH2016014)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)21-0037-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.008