胃癌组织中CTSD、HSP90α、EGFR的表达及临床意义

李 禹，程爱兰

胃癌组织中CTSD、HSP90α、EGFR的表达及临床意义

李 禹1,2，程爱兰1

目的检测组织蛋白酶D(Cathepsin D, CTSD)、热休克蛋白90α(heat shock protein 90α, HSP90α)、表皮生长因子受体(epidemal growth factor receptor, EGFR)蛋白及其mRNA在胃癌组织中的表达及其与胃癌临床病理特征的关系，初步探讨CTSD、HSP90α、EGFR在胃癌发生、发展及浸润转移过程中的作用。方法采用免疫组化及原位杂交(in situ hybridization, ISH)法检测110例正常胃黏膜组织、83例癌旁异型增生组织、110例胃癌组织及78例胃癌淋巴结转移组织中CTSD、HSP90α、EGFR蛋白及其mRNA的表达。结果(1)CTSD、HSP90α、EGFR蛋白在110例正常胃黏膜组织、83例癌旁异型增生组织、110例胃癌组织及78例胃癌淋巴结转移组织中的阳性率分别为0、18.07%、80.91%、92.31%；0.9%、15.66%、75.45%、89.74%；0、12.05%、69.09%、84.62%。(2)相关分析结果显示，CTSD、HSP90α、EGFR在胃癌组织中的表达呈两两正相关(rs=0.853，P<0.05；rs=0.639，P<0.05；rs=0.734，P<0.05)。(3)CTSD、HSP90α、EGFR在胃癌中的表达均与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期相关(P<0.05)；与患者年龄、性别、肿瘤大小无显著相关性(P>0.05)。结论CTSD、HSP90α与EGFR可能与胃癌发生、发展以及侵袭转移等恶性生物学行为密切相关。

胃肿瘤；CTSD；HSP90α；EGFR；临床病理特征

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。我国胃癌的发病率及病死率均明显高于全球平均水平。在前期工作中，课题组利用蛋白质组学及生物信息学方法筛选并鉴定了高转移鼻咽癌细胞中组织蛋白酶D(Cathepsin D, CTSD)的相互作用蛋白，发现CTSD/热休克蛋白90α(heat shock protein 90α, HSP90α)/表皮生长因子受体(epidemal growth factor receptor, EGFR)在鼻咽癌细胞中形成相互作用组并能促进其侵袭转移[1]，CTSD/HSP90α/EGFR在胃癌中是否也具有协同作用及促进其侵袭转移尚不明确。本文采用免疫组化及原位杂交(in situ hybridization, ISH)法检测不同胃病变组织中CTSD、HSP90α和EGFR蛋白及其mRNA的表达，旨在探讨它们与胃癌发生、发展的关系，为寻找胃癌肿瘤标志物提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1一般材料收集2014年7月～2015年6月南华大学附属第一医院存档的胃癌手术切除标本，包括正常胃黏膜组织110例、异型增生组织83例、胃癌组织110例和淋巴结转移性癌组织78例，其中男性73例，女性37例；年龄27～81岁，平均58.29岁。分化程度：高分化6例，中分化20例，低+未分化84例；无区域性淋巴结转移者32例，1～6枚区域性淋巴结转移者29例，7～15枚区域性淋巴结转移者30例，>15枚区域性淋巴结转移者19例；浸润深度：肿瘤浸润至固有层及黏膜下层9例，肌层29例，浆膜层72例；肿瘤直径：≥6 cm者23例，<6 cm者87例。TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期25例，Ⅲ期59例，Ⅳ期6例。以上病理结果均经两名以上病理医师确认。所有患者术前均未行放疗或化疗。

1.2试剂CTSD抗体及SP免疫组化检测试剂盒购自福州迈新公司，HSP90α抗体、CTSD和EGFR ISH试剂盒均购自武汉博士德公司，兔抗EGFR抗体购自北京中杉金桥公司，HSP90α ISH试剂盒购自广州伯信公司。

1.3方法

1.3.1免疫组化 采用免疫组化SP法染色。石蜡切片常规脱蜡水化，抗原修复，分别滴加3%H2O2内源性过氧化物酶抑制剂10 min，PBS缓冲液冲洗，滴加CTSD、HSP90α、EGFR一抗后4 ℃冰箱过夜，次日分别滴加二抗和SP溶液，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3.2ISH 切片常规脱蜡水化，0.25%乙酸酐酸化，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段，后固定，预杂交，杂交，杂交后洗涤，封闭，滴加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶后，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4统计学处理采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。定性资料的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法进行显著性检验，各指标相关性采用Spearman相关分析；采用Kappa检验比较其免疫组化和ISH的检测结果。

2 结果

2.1CTSD、HSP90α、EGFR蛋白及其相应mRNA在不同胃病变中的表达CTSD、HSP90α、EGFR蛋白在110例正常胃黏膜组织、83例癌旁异型增生组织、110例胃癌组织及78例胃癌淋巴结转移组织(图1)中的阳性率分别为0、18.07%、80.91%、92.31%；0.9%、15.66%、75.45%、89.74%；0、12.05%、69.09%、84.62%。相应CTSD mRNA、HSP90α mRNA、EGFR mRNA(图2)的阳性率分别为0、7.22%、65.45%、76.92%；0、14.46%、60.91%、67.95%；0、12.05%、60.91%、75.64%(表1)。

2.2CTSD、HSP90α和EGFR蛋白与mRNA表达的一致性分析Kappa检验，CTSD、HSP90α和EGFR与其相应的mRNA在胃癌组织中的表达均具有一致性(κ=0.603，P<0.05；κ=0.700，P<0.05；κ=0.455，P<0.05)。

2.3胃癌组织中CTSD、HSP90α与EGFR三者之间的关系相关分析结果显示，CTSD与HSP90α、CTSD与EGFR、HSP90α与EGFR在胃癌组织中的表达呈正相关(rs=0.853，P<0.05；rs=0.639，P<0.05；rs=0.734，P<0.05)。

①A①B①C②A②B②C

图1胃癌组织中CTSD、HSP90α和EGFR蛋白的表达：A.CTSD；B.HSP90α；C.EGFR，SP法图2胃癌组织中CTSD mRNA、HSP90α mRNA和EGFR mRNA的表达：A.CTSD；B.HSP90α；C.EGFR，ISH

表1 不同胃组织中CTSD、HSP90α、EGFR蛋白及其相应mRNA的表达

胃癌vs正常胃黏膜组织，P<0.05；胃癌vs癌旁异型增生组织，P<0.05；胃癌vs胃癌淋巴结转移组织，P<0.05

2.4CTSD、HSP90α、EGFR表达与胃癌临床病理特征的关系CTSD、HSP90α、EGFR表达均与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期相关(P<0.05)；与患者年龄、性别、肿瘤大小无显著相关性(P>0.05，表2)。

表2 CTSD、HSP90α、EGFR表达与胃癌临床病理特征的关系

3 讨论

近年研究认为胃癌是由多种内外因素介导细胞多种基因结构损伤和表达异常所致，是多步骤的复杂过程，其发生过程中涉及大量癌基因的活化和抑癌基因的失活。因此研究与胃癌发生、发展相关基因或蛋白质，发现具有诊断意义的肿瘤标志物，一直是亟待解决的课题。

CTSD是一种广泛存在于不同组织细胞和肿瘤细胞的溶酶体天冬氨酸类肽链内切酶，因其生物学功能多样性而倍受关注。Nirdé等[2]研究发现乳腺癌细胞过表达CTSD可通过促进HSP70的分泌来促进高密度肿瘤细胞的增生。Vashishta等[3]采用转染方法使低分泌CTSD的NCI-H23肺癌细胞系大量分泌CTSD，发现NCI-H23细胞系的侵袭和转移潜能显著增强。本组实验结果显示，CTSD在高分化胃癌组织、无淋巴结转移的胃癌组织中的表达水平显著低于中～未分化胃癌组织及有淋巴结转移的胃癌组织，且浸润深度越深、TNM分期越高，CTSD的表达水平越高，提示CTSD的异常表达可能与胃癌的发生、发展具有重要作用，与徐晓艳等[4]、Dian等[5]的研究结果基本一致。

HSP90α是一种伴侣蛋白，辅助蛋白折叠，在肿瘤细胞中，HSP90α能够使过度激活或突变的信号传导蛋白保持活性，加速肿瘤细胞的恶性转变。同时，HSP90α也能调控整合素信号转导及黏着斑的稳定和功能、影响肿瘤血管形成，参与一些肿瘤的侵袭转移过程。有研究表明，在胃癌、胰腺癌等实体肿瘤中HSP90α高表达且HSP90α表达与肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、病理分期等密切相关，其表达越高，预示预后越差[6-7]。本组实验结果发现，分化程度越低、浸润深度越深、淋巴结转移个数越多，胃癌组织中HSP90α的表达水平越高。这些结果提示HSP90α对胃癌发生、发展、侵袭、转移可能有一定的作用，与王佳泓等[8]报道的在胃癌组织中HSP90表达与浸润深度、淋巴结转移个数、TNM分期相关的结果基本一致。

已有研究表明，如大肠癌、胃癌以及食管癌等上皮细胞来源的恶性肿瘤均存在EGFR蛋白的表达及过表达现象，进而促进癌细胞的增殖、血管生成、侵袭和转移，抑制癌细胞的凋亡[9-10]。Weng等[11]采用DNA甲基化检测显示EGFR启动子甲基化可能是胃癌发生、发展的表观遗传学的生物标志。本组实验结果显示，在胃癌组织中EGFR表达均与胃癌分化程度、浸润深度、淋巴结转移个数、TNM分期相关，与患者性别、年龄、肿瘤大小无关，提示EGFR的过度激活在胃黏膜正常细胞的转化过程以及胃癌组织中恶性细胞的演进过程中扮演重要角色。

王娅兰等[12]利用免疫组化法检测结直肠癌中CTSD与EGFR的表达，两者呈正相关，且CTSD阳性者淋巴结转移率明显高于阴性者，并认为EGFR可以增加CTSD转录，从而与促进其分泌有关。陈春凤等[13]的实验结果显示非小细胞肺癌中EGFR与CTSD表达呈明显正相关，并发现CTSD与EGFR表达具有协同作用，共同促进肿瘤发展。刘世全等[14]的实验结果显示食管鳞状细胞癌中EGFR与HSP90α的表达呈正相关，且两者表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移个数及TNM分期呈正相关，并认为这可能与HSP90α作为分子伴侣可协助EGFR维持其基本功能有关。实验发现CTSD、HSP90α及EGFR呈两两正相关，提示CTSD、HSP90α及EGFR可能在胃癌中形成相互作用组并共同促进胃癌的发生、发展及浸润、转移，而具体机制尚需进一步探讨。

总之，CTSD、HSP90α与EGFR的表达水平可能与胃癌的发生、发展及侵袭转移等恶性生物学行为密切相关。

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ExpressionofCTSD,HSP90αandEGFRingastriccancerand
theirclinicalsignificance

LI Yu1,2, CHENG Ai-lan1

(1CancerResearchInstitute,KeyLaboratoryofTumourCellandMolecularPathology,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;2AnxiangPeople’sHospital,Changde415600,China)

PurposeTo detect the expression of Cathepsin D(CTSD), heat shock protein 90α (HSP90α) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in gastric cancer(GC) tissues and to analyze the association of their expression levels and clinical pathological features of GC, the role of CTSD, HSP90α, EGFR in the carcinogenesis, progression, invasion and metastasis of GC.MethodsThe expression of CTSD, HSP90α and EGFR in normal gastric mucosa, dysplasia adjacent to carcinoma, GC tissues and lymph node metastasis was measured by immunohistochemistry (IHC) and in situ hybridization (ISH).ResultsIn 110 cases of normal gastric mucosa, 83 cases of dysplasia adjacent to carcinoma, 110 cases of GC and 78 cases of the lymph node metastasis, the positive rate of CTSD, HSP90α, EGFR protein was 0, 18.7%, 80.91% and 92.31%, 0.9%, 15.66%, 75.45% and 89.74%, 0, 12.05%, 69.09% and 84.62%, respectively. Correlation analysis showed that the expression CTSD, HSP90α and EGFR in GC tissues was positively correlated (rs=0.853,P<0.05,rs=0.639,P<0.05,rs=0.734,P<0.05). Expression of CTSD, HSP90α and EGFR in GC was correlated with the degree of tumor differentiation, invasive depth, number of lymph node metastasis and TNM stages (P<0.05). There was no significant correlation with the patient's age, sex, tumor size (P>0.05).ConclusionCTSD, HSP90α and EGFR may be associated with malignant behavior, development and invasion and metastasis of GC.

gastric neoplasms; CTSD; HSP90α; EGFR; clinicopathologic features

R 735.2

A

1001-7399(2017)10-1074-04

时间：2017-10-23 13:30 网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.003.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.003

接受日期：2017-08-16

国家自然科学基金(81372894、81072198)、湖南省教育厅重点项目(10A104)

1南华大学医学院肿瘤研究所，衡阳 421001

2湖南省常德市安乡县人民医院病理科，常德 415600

李 禹，女，硕士，医师。E-mail: 526756791@qq.com

程爱兰，女，博士，硕士生导师，通讯作者。E-mail: ailan_cheng@hotmail.com