用于无创产前诊断的SRY基因高灵敏高特异检测方法研究

刘琳琳+郑梦琳+邹秉杰+宋沁馨+周国华

]摘 要 通过检测母体外周血中胎儿游离DNA（cffDNA）的SRY基因，确定胎儿性别，可评估胎儿性连锁遗传病的发病风险，降低病儿出生率。本研究建立了高灵敏、高特异、闭管检测不易污染的实时荧光PCR偶联核酸侵入反应方法用于SRY基因的检测。通过优化反应体系中的检测探针浓度、FEN1酶用量、Taq酶用量及预扩增退火温度，确定了最佳的反应条件，即检测探针浓度为250 nmol/L、FEN1酶用量为7.5 U、Taq酶用量为0.5 U、预扩增退火温度为67℃。在最佳反应条件下， 实现对含量低至4‰ （4 copies/μL）的模拟样本的检测，并成功检测两例孕期分别为9周和10周的临床实际样本。结果表明， 所建立的方法可用于母体外周血cffDNA的SRY基因检测，为临床开展基于SRY基因的无创产前诊断提供了新方法。

1 引 言

我国是人口大国，约4%的新生儿受到一种或多种先天性疾病的影响，而在所有的先天性疾病中，大约35%为遗传性疾病[1]。产前诊断可在胎儿出生前了解胎儿的发育状态，及时进行干预治疗。传统的产期诊断方法有羊膜腔穿刺、绒毛活检等，它们是目前临床产前诊断的“金标准”，虽然可以给出大多数染色体疾病的明确结果，但伴随着宫内感染和约0.2%～0.5%的胎儿流产风险[2， 3]。无创性产前诊断（Noninvasive prenatal diagnosis， NIPD）是指利用母体外周血中胎儿成分或是胎儿特异性标志物进行的遗传学分析或诊断[4]，这些胎儿成分或特异性标志物包括胎儿有核红细胞、胎儿游离DNA（Cellfree fetal DNA， cffDNA）等。1989年，Lo等[5]发现孕妇外周血中存在胎儿有核红细胞，但Price等[6]估计母体外周血中胎儿有核红细胞含量很低，富集获取困难，并且在产后几年内长期存在于母血中，使其临床应用受到限制。1997年，Lo等[7]首次报道了母体外周血中存在cffDNA； 随后，又通过实时荧光PCR方法测得孕妇血浆中cffDNA占血浆总DNA的3.4%～6.2%，含量远高于孕妇外周血中胎儿细胞DNA[8]。接着，从血浆中提取cffDNA的有效性和稳定性得到证实[9]。此外，cffDNA具有诸多适合产前诊断的特点，如半衰期短、清除快； 不受母體之前妊娠干扰[10]； 可进行实时动态监测； 可从长度上与母体游离DNA进行区分。cffDNA作为理想的产前诊断胎儿成分，已成为NIPD领域的研究热点。

SRY基因是位于Y染色体短臂上的男性性别决定基因，人的SRY基因只含有1个外显子，没有内含子，转录单位长度约1.1 kb，编码一个含有204个氨基酸的蛋白质[11]。以SRY基因为检测靶标，通过对cffDNA的SRY基因检测确定胎儿性别，可评估如甲型血友病[12]、杜式肌营养不良等性连锁遗传病的发病风险，降低病儿的出生率[13]。

常见的SRY基因检测方法有普通PCR[7]，灵敏度低、容易污染； 巢式PCR[14]，虽然灵敏度和特异性有所提高，但仍需开管电泳分析； 最普遍使用的方法是实时荧光PCR[8， 15]，灵敏度高、不易污染但需较贵的Taqman探针。为此，本研究建立一种基于实时荧光PCR偶联核酸侵入反应的SRY基因检测方法，将基于PCR的模板扩增与基于核酸侵入反应的信号放大技术相结合，具有高灵敏、高特异、低成本、闭管检测不易污染等优点。最终实现对含量低至4‰ （4 copies/μL）的模拟样本的检测，并成功检测两例孕期分别为9周和10周的临床实际样本。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

RotorGene Q实时荧光定量PCR仪（德国Qiagen公司）； Allegra X30冷冻离心机（美国Beckman Coulter公司）； Wizard Genomic DNA Purification Kit（美国Promega公司）； QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit（德国Qiagen公司）； FEN1核酸内切酶（实验室自表达[16，17]）； Taq 酶（美国Promega公司）； 3（N吗啉基）丙磺酸（MOPS， 美国Amresco公司）； MgCl2（美国NEB公司）； dNTP（上海赛百盛公司）； 其它试剂均为分析纯； 实验用水均为灭菌双蒸水。

2.2 样本收集与处理

孕妇EDTA抗凝血样本由南京军区南京总医院提供，取4 mL新鲜外周血以7400 r/min离心10 min， 小心吸取上层血浆置于干净离心管中， 13000 r/min再离心10 min得到血浆样本，按照QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit的操作说明提取血浆游离DNA，置于 30℃保存待用。

2.3 实验方法

2.3.1 实时荧光PCR偶联核酸侵入反应与体系优化 （1）反应初始体系 1×反应缓冲液（10 mmol/L MOPS、7.5 mmol/L MgCl2，pH 7.5），dNTPs各250 μmol/L，上下游引物各500 nmol/L，侵入探针50 nmol/L， 检测探针250 nmol/L，荧光发夹探针250 nmol/L，Taq酶0.5 U，FEN1酶7.5 U，基因组DNA 1 μL， 用H2O补充到20 μL。（2）反应程序 预变性（95℃，3 min）； 10个循环预扩增（95℃，20 s； 67℃，30 s； 70℃，30 s）； 35个循环扩增（95℃，20 s； 63℃，60 s，读取荧光信号； 70℃，30 s）。在进行反应体系优化时，分别改变Taq酶用量（0.5 U、1 U、2 U、4 U）、FEN1酶用量（1.5 U、3 U、7.5 U）、检测探针浓度（250、500、1000和2000 nmol/L）及预扩增退火温度（67℃、70℃、72℃），比较各条件下SRY基因扩增的Ct值及荧光信号曲线强度和斜率，选择最优的反应条件。endprint

2.3.2 方法學的灵敏度、特异性和重复性考察 在优化后的反应体系中加入10倍梯度稀释的男性基因组DNA模板，终浓度为105～100拷贝/20 μL反应液，考察方法的灵敏度； 在优化后的反应体系中加入未孕女性基因组DNA，考察方法的特异性； 在优化后的反应体系中加入高中低3个浓度的男性基因组DNA，终浓度分别为105、103和101拷贝/20 μL反应液，每个浓度重复检测3次考察方法的重复性。

2.3.3 样本分析 将男性基因组DNA和未孕女性基因组DNA按比例混合，得到不同SRY基因含量的模拟样本。此外，还收集了2例孕期分别为9周和10周的母体外周血样本。每次实验包含待测样本DNA、阳性对照（男性基因组DNA）、阴性对照（未孕女性基因组DNA）、空白对照。

3 结果与讨论

3.1 实时荧光PCR偶联核酸侵入反应方法原理

实时荧光PCR偶联核酸侵入反应的原理如图1所示，根据待测靶标序列设计上下游引物、侵入探针、检测探针和荧光发卡探针。反应包括两个阶段，第一个阶段是只进行PCR反应的模板预扩增，第二阶段发生PCR偶联核酸侵入反应，在63℃的PCR扩增循环退火阶段同时发生核酸侵入反应，此时侵入探针及检测探针与靶标杂交形成三碱基重叠结构，FEN1酶特异性识别这种结构并切割检测探针，产生Flap片段，Flap片段可与一条修饰了荧光基团和淬灭基团的荧光发夹探针退火，再次形成三碱基重叠结构而被FEN1酶识别并将荧光基团切割下来，荧光发卡探针的荧光基团与淬灭基团分离产生荧光信号。因此，在每个扩增循环中采集荧光信号，即可得到实时荧光扩增曲线。

在设计探针时，使检测探针3′端特异序列的Tm值和Flap片段的Tm均接近63℃，则在63℃退火阶段，检测探针与模板的退火结合以及Flap片段与荧光发卡探针的退火结合处于一种杂交和解离的动态过程，且完整的检测探针与模板，荧光发卡探针与Flap片段形成下一轮的切割，不断循环的核酸侵入反应使信号放大106～107倍[18，19]。

3.2 实时荧光PCR偶联核酸侵入反应条件的优化

为使SRY基因扩增得到Ct值最小及荧光信号曲线强度和斜率最佳，分别对影响反应的主要因素：检测探针浓度、FEN1酶用量、Taq酶用量及预扩增退火温度进行优化，结果如图2所示。随着Taq酶用量的增加，荧光信号曲线的Ct值增大，可能是Taq酶用量的增加竞争性地抑制了核酸侵入反应，因此Taq酶用量确定为0.5 U（图2A）。随着FEN1酶用量的减少，荧光信号曲线的Ct值增大，当FEN1酶用量为1.5 U时，荧光信号曲线斜率已经开始下降，为了缩短反应时间，FEN1酶最佳用量确定为7.5 U（图2B）。随着检测探针浓度的增加， 荧光信号曲线的Ct值会减小，但是减小的程度不大，且荧光信号曲线的强度和斜率都没有减弱的趋势，从降低成本方面考虑，检测探针浓度确定为250 nmol/L（图2C）。随着预扩增退火温度的增加，荧光信号曲线的Ct值增加，因而预扩增退火温度确定为67℃（图2D）。最终得到反应的最佳条件为： 250 nmol/L检测探针、 7.5 U FEN1酶、0.5 U Taq酶、67℃预扩增退火。

（A） 不同Taq 酶用量的检测结果：1、2、3、4分别是Taq酶为0.5 U、1 U、2 U、4 U时的检测结果，5、6分别为阴性对照和空白对照； （B） 不同FEN1酶用量的检测结果：1、2、3分别是FEN1酶为7.5 U、3 U、1.5 U时的检测结果，4、5分别为阴性对照和空白对照； （C） 不同检测探针浓度的检测结果：1、2、3、4分别是检测探针浓度为2000、1000、500和250 nmol/L时的检测结果，5、6分别为阴性对照和空白对照； （D） 不同预扩增退火温度的检测结果：1、2、3分别是预扩增退火温度为67、70和72℃时的检测结果，4为空白对照。

Fig.2 Optimized results of reaction conditions for SRY gene detection

（A） Detection results with different amounts of Taq polymerase： 1， 2， 3 and 4 are detection results with 0.5 U， 1 U， 2 U and 4 U Taq polymerase， 5 and 6 are negative control and blank control； （B） Detection results with different amounts of FEN1 enzyme： 1， 2 and 3 are detection results with 7.5 U， 3 U and 1.5 U FEN1 enzyme， 4 and 5 are negative control and blank control； （C） Detection results with different concentrations of detection probe： 1， 2， 3 and 4 are detection results with 2000， 1000， 500 and 250 nmol/L detection probe； 5 and 6 were negative control and blank control； （D） Detection results with different annealing temperatures in preamplification： 1， 2 and 3 are detection results with annealing temperature of 67℃， 70℃ and 72℃， 4 is blank control.endprint

3.3 实时荧光PCR偶联核酸侵入反应检测的灵敏度、特异性和重复性

得到最佳反应体系后，对SRY基因的扩增性能进行考察，如图3所示。在检测体系中分别加入终浓度为105～100拷贝的男性基因组DNA考察检测的灵敏度，同时在检测体系中加入了未孕女性基因组DNA考察检测特异性。结果表明，本方法能检测出10拷贝的男性基因组DNA（图3A），未孕女性基因组DNA无荧光信号，表明该方法特异性良好（图3B）。此外，在检测体系中加入高中低3个浓度的男性基因组DNA（105、103、101拷贝/20 μL反应液），每个浓度重复检测3次考察方法的重复性（图3C），在检测高浓度样品时，3条荧光信号曲线的平均Ct=5.9，RSD=1.36%； 中浓度时，平均Ct=11.98，RSD=1.17%； 低浓度时，平均Ct=19.32，RSD=4.7%，说明本方法在检测高浓度和中浓度时重复性良好，在检测下限时重复性有所下降，但也能满足检测要求。

3.4 样本检测结果

cffDNA占母体外周血中总游离DNA的10%～20%[8]。为了模拟真实样本，采用1000 copies/μL未孕女性基因组DNA 4倍梯度稀释1000 copies/μL的男性基因DNA，分别得到男性基因组DNA浓度为1000、250、62.5、15.6 和4 copies/μL的模拟样本，男性基因组DNA所占比例分别为100%、25%、6.2%、1.6%、4‰（图4A）。对4‰男性基因组DNA进行3次重复检测，有两次出现阳性信号，表明本方法能检测到67%的含量为4‰（4 copies/μL）的模拟样本。采用本方法检测了两例孕期分别为9周和10周的母体血浆样本，检测的两名胎儿性别分别为一男一女（图4B），与后续随访结果一致。

（A） 模拟样本检测结果：17为20 μL反应液中男性基因组DNA为10004拷贝的检测结果，8、9为阴性对照和空白对照； （B） 临床实际样本检测结果：3、4分别为阴性对照和空白对照

Fig.4 Detection results of samples

（A） Detection results of simulated samples： 1 to 7 are detection results of 1000 to 4 copies male genomic DNA per 20 μL reaction liquid， 8 and 9 are negative control and blank control； （B） Detection results of clinical samples： 3 and 4 are negative control and blank control.

4 結 论

早在2003年，英国遗传学检测网络就批准了通过检测孕妇外周血中cffDNA的SRY基因进行无创性胎儿性别诊断，以用于性连锁遗传疾病的产前筛查[20]。常见的SRY基因检测方法有普通PCR[7]，灵敏度低、容易污染； 巢式PCR[14]，虽然灵敏度和特异性都有所提高，但仍需开管电泳分析； 最普遍使用的方法是实时荧光PCR[8，15]，灵敏度高、不易污染但需较贵的Taqman探针。本研究建立的实时荧光PCR偶联核酸侵入反应方法具有以下优点：（1）高灵敏。本方法将基于PCR的模板扩增与基于核酸侵入反应的信号放大技术相结合，非常适合于孕妇外周血中微量cffDNA的检测； （2）高特异性。FEN1酶特异识别模板、侵入探针和检测探针形成的三碱基重叠结构并产生切割，在没有形成碱基重叠时，FEN1酶活性很弱； （3）通用性好。荧光发卡探针为通用探针，无需针对每个检测位点专门设计； （4）无污染。检测过程无需开盖，减少了交叉污染的可能性； （5）操作简便，检测速度快。实验操作只包含模板制备和体系配制，可在2 h内完成检测； 本课题组之前利用实时荧光PCR偶联核酸侵入反应检测单核苷酸多态性[21]，但是它为单碱基序列差异，检测通常存在一定的背景信号，而本研究以仅存在于Y染色体上的SRY基因为检测靶标，定性检测其是否存在，几乎没有背景干扰。本方法可检测含量低至4‰（4 copies/μL）的模拟样本，并成功检测两例临床实际样本。文献[22]报道在5周龄孕妇的血浆cffDNA中可检测到SRY基因，而本研究样本量有限，只检测了两例实际样本，且孕期为9周和10周，下一步准备扩大样本量，探索本方法可进行检测的最小孕妇周龄。cffDNA片段长度为193～313 bp，远小于母体游离DNA长度[23]，因此，可以尝试将基于片段差异的cffDNA富集方法与高灵敏的检测方法结合，进一步提高检测准确性。此外，本方法可与微量血液、毛发等特殊样本的提取方法结合，应用于法医鉴定领域[24]。endprint