高效液相色谱法测定牛奶中的联苯

肖付刚，王德国，孙军涛，袁展翅

(许昌学院食品与生物工程学院，河南 许昌 461000)

高效液相色谱法测定牛奶中的联苯

肖付刚，王德国，孙军涛，袁展翅

(许昌学院食品与生物工程学院，河南 许昌 461000)

为了研究联苯从塑料包装中转移至牛奶的情况，建立了牛奶中联苯的高效液相色谱(HPLC)检测方法，并用此方法对实际样品进行了检测。结果表明，联苯标准溶液在0.051～3.176 mg·L-1范围内，标准曲线线性良好，回归方程为y=29.187x+8.687，相关系数(R2)为0.999。该方法的检出限为0.010 3 mg·L-1，加标回收率为99.8%～103.6%，相对标准偏差(RSD)为3.6%。

联苯；塑化剂；高效液相色谱

20世纪50年代后，高分子材料研究快速发展，合成材料越来越多地应用在国民经济的各个部门以及人民生活的各个方面，其中方便塑料袋就是典型的例子。塑料的生产中，为改善工艺性能，往往加入增塑剂等助剂，在一定的条件下，助剂可从塑料包装迁移到食品中，污染食品，最终对人体健康带来威胁[1-3]。塑化剂在食品安全事件最醒目的例子是，2012-11-19，《2l世纪网》刊发《致命危机：酒鬼酒塑化剂超标260%》的调查报告，酒鬼酒中检出塑化剂，随后在多种高端白酒中也检出塑化剂，给白酒行业带来严重的信任危机[4]。联苯可用作塑化剂，其化学式如图1所示，熔点为68.5 ℃，沸点为255 ℃，不溶于水、酸及碱，溶于醇、醚、苯等有机溶剂[5]。其对皮肤、黏膜有轻度刺激性，高浓度吸入主要损害神经系统和肝脏，可致过敏性或接触性皮炎。对呼吸道和眼睛有明显刺激，长期接触可引起头痛、乏力、失眠等以及呼吸道刺激症状。联苯对人体有严重危害，食品中禁止含有，但有可能从塑料包装中转移至食品，因此建立食品中联苯的准确、快速的检测方法很有必要。本试验在此背景下建立了牛奶中联苯的HPLC检测方法。

图1 联苯的化学分子式 Fig.1 Chemical molecular of biphenyl

1 材料与方法

1.1材料与试剂

甲醇(高效液相色谱级)，郑州派尼化学试剂厂；正己烷，国产分析纯；联苯标准品，纯度≥99%，分析标准品，郑州派尼化学试剂厂。

1.2仪器与设备

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪：配有二级管阵列检测器，四元泵，Agilent poroshell 120 EC-C18(4.6×50 mm, 2.7 μm)色谱柱，美国Agilent公司；0.45 μm微孔滤膜，Bond Elut C18固相萃取柱，美国Agilent公司；PS-Ⅱ-10实验室超纯水系统设备，湖南科尔顿水务有限公司；TG16-WS台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；S00-3201数控定时超声波清洗机，上海声彦超声波仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1 样品处理 称取5.000 g牛奶于离心管中，加入20 mL正己烷，超声萃取40 min，8 000 r·min-1离心20 min，取上清液1.00 mL·min-1过C18固相萃取柱，甲醇洗脱，吹干后再用甲醇定容至1 mL。最后用0.45 μm滤膜过滤后，放于4 ℃冰箱储存备用。

1.3.2 联苯标准溶液的配制 取联苯标准储备液0.079 4 g·L-1，用甲醇依次稀释配制3.176、1.270、0.635、0.254、0.051 mg·L-1系列质量浓度的标准溶液，放于具塞棕色样品瓶中，并编号。在4 ℃冰箱中贮存备用。

1.3.3 色谱条件 以甲醇和水为流动相，进行梯度洗脱的条件为：0～20 min，甲醇：40%～90%；流量：1.00 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样体积：5 μL；柱温：30 ℃。

1.3.4 方法检出限 最小检测质量浓度的检定如下[6]：在1.3.3的色谱条件下，进样3.176 mg·L-1的联苯标准溶液5 μL，记录色谱图，由色谱峰高和基线噪声峰峰高，按公式(1)计算最小检测质量浓度CL。

CL=2NdCV/(20H)

(1)

式中：CL为最小检测质量浓度，mg·L-1；Nd为基线噪声峰峰高；C为标准溶液质量浓度，mg·L-1；H为标准溶液的色谱峰高；V为进样体积，μL；2为2倍信噪比，理论值；20为按进样量20 μL计。

2 结果与分析

2.1联苯标准曲线方程

用配制好的联苯标准溶液分别进行HPLC测定，以质量浓度x(mg·L-1)为横坐标，各组分的色谱峰面积平均值(3次平行)y为纵坐标，进行线性回归，绘制联苯标准曲线。试验结果表明，标准曲线方程为y=29.187x+8.687，在0.051～3.176 mg·L-1质量浓度范围内线性良好(R2=0.999)。联苯标准曲线方程见图2，联苯标准溶液(1.270 mg·L-1)的HPLC色谱图见图3。

图2 联苯标准溶液曲线Fig.2 Curve of biphenyl standard

图3 联苯标准溶液(1.270 mg·L-1)的HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of biphenylstandard(1.270 mg·L-1)

2.2方法检出限

按照1.3.4中的方法测定方法检出限，进样3.176 mg·L-1的联苯标准溶液5 μL，基线噪声峰-峰高Nd为0.059；标准溶液的色谱峰高H为9.07，按公式(1)计算得方法的检测限为0.010 3 mg·L-1。

2.3加标样品回收率的测定

为了验证分析方法的可靠性，对样品进行加标回收试验。将标准溶液配制成3.176、0.635 mg·L-12个不同质量浓度的标准使用液，加入蒙牛纯牛奶样品中，经过3次平行添加试验进行回收率的测定，计算得平均回收率为99.8%～103.6%，结果如表1所示。

表1 加标样品的回收率Table 1 Recoveries of spiked samples mg

2.4加标样品精密度的测定

为验证方法的精密度，对1个浓度为6.352 mg·L-1的加标样品重复进样5次，计算得RSD为3.6%(表2)。一般规定，μg级RSD为10%左右[7]，所以本方法完全达到要求，准确性较好，精密度较高。

表2 方法的精密度Table 2 Method precision

2.5实际样品测定结果

按照1.3.1中的方法制备样品，制备好的样品每次5 μL进行HPLC检测(平行测定3次)。结果(见表3)表明，根据疑似联苯峰峰面积代入标准方程得到质量浓度结果为负值，因此视为3种牛奶中均未检出联苯(或含量低于检测限)，其色谱图如图4—图6。

表3 样品测定结果Table 3 Results of sample measurement

图4 蒙牛纯牛奶HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of Mengniu pure milk

3 结论与讨论

本试验建立了牛奶中联苯的HPLC检测方法，标准曲线回归方程为y=29.187x+8.687，R2=0.999，方法的检出限为0.010 3 mg·L-1，回收率为80.1%～103.6%，RSD为3.6%，一般规定，μg级RSD为10%，所以本方法完全达到要求，准确性较好，精密度比较高。

图5 伊利纯牛奶HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of Yili pure milk

图6 花花牛酸奶HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatogram of Huahuaniu yogurt

通过对3种牛奶样品中的联苯进行检测，结果表明，根据疑似联苯峰面积代入标准方程得到质量浓度结果为负值，因此视为3种牛奶中均未检出联苯(或含量低于检测限)。

通过检测限、加标回收率、精密度以及实际样品的测定，结果表明本方法准确、快捷、可靠，重现性较好，可用于牛奶样品中联苯的检测。

联苯是可疑致突变剂，联苯在适当催化剂存在下逐步形成的多氯联苯或多溴联苯，是严重的致癌和致畸剂，联苯及其衍生物在自然条件下难降解，可造成环境的长期污染[8-10]。因此，建立食品中联苯的准确、快捷、可靠的检测方法是保障食品安全的必要措施。本研究建立的方法除用于牛奶样品的检测外，也可用于其他食品样品的检测，可为标准检测方法的建立提供参考，为监管部门提供依据。

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[4] 奇云. “白酒塑化剂危机”再敲食品安全警钟——非法食品添加物“塑化剂”解读[J].城市与减灾,2013(1):1-4.

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[7] 王永华. 食品分析[M].第2版. 北京: 中国轻工业出版社, 2013:362.

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(责任编辑：李莹)

Determinationofbiphenylinmilkbyhighperformanceliquidchromatography

XIAO Fugang, WANG Deguo, SUN Juntao, YUAN Zhanchi

(School of Food and Bioengineering, Xuchang College, Xuchang 461000, China)

To study the biphenyl transferring to milk from plastic packaging, high performance liquid chromatography (HPLC) method for detecting biphenyl in milk was established in this experiment. The results show that the regression equation of Biphenyl standard isy=29.187x+8.687, and correlation coefficient (R2) is 0.999. It is good linearity of standard curve from 0.051 mg·L-1to 3.176 mg·L-1. The detection limit of the method is 0.010 3 mg·L-1, the recovery rate is from 99.8% to 103.6%, and the relative standard deviation (RSD) is 3.6%.

biphenyl; plasticizer; high performance liquid chromatography (HPLC)

2017-02-25

河南省科技攻关重点项目(112102210310)；河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目(2013GGJS-168)

肖付刚(1978-)，男，河南确山人，副教授，博士，主要从事食品安全快速检测技术，农副产品精深加工及特种食材研究。

1000-2340(2017)05-0730-04

TS201.6

A