酸性氧化铝用于甜叶菊甜菊糖苷分析样品前处理

罗庆云，李小燕，邓瑞欣，王甜甜，叶杨潇，尚进

（南京农业大学园艺学院，南京210095）

酸性氧化铝用于甜叶菊甜菊糖苷分析样品前处理

罗庆云*，李小燕*，邓瑞欣，王甜甜，叶杨潇，尚进

（南京农业大学园艺学院，南京210095）

为促进甜菊糖苷提取用甜叶菊新品种选育，以非糖苷类杂质和甜菊糖苷的检出量为指标，比较了各吸附剂用于甜叶菊种质甜菊糖苷高效液相检测用样品前处理的可行性，并建立了有效的高效液相检测用样品前处理方法。结果表明，甜叶菊叶片经50%乙醇超声浸提后，在所调查的几种吸附剂添加处理中，以酸性氧化铝对浸提液中非糖苷类杂质的去除效果最好，且对以RA和STV为代表的甜菊糖苷含量影响小。进一步的研究揭示，酸性氧化铝用于甜叶菊叶片50%乙醇提取液高效液相检测用样品的前处理优化方案为：在甜叶菊叶片的50%乙醇提取液中加入1/5（m：v）酸性氧化铝，40r/min室温振荡30min，可使提取液中非糖苷类杂质检出量减少65.0%以上，且对以RA和STV为代表的甜菊糖苷检出量的影响小于3.0%。

甜叶菊；甜菊糖苷；高效液相色谱法；样品前处理

甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni）为原产于巴拉圭的菊科多年生草本植物[1]，除含色素、鞣质、多酚、多糖、树胶、粗纤维和蛋白质外[2-3]，其叶片中含有种类丰富的萜类化合物，其中以四环二萜为母核的糖苷类化合物（简称甜菊糖苷）就达44种以上[4]。到目前为止，包含Rebaudioside A（RA）和Stevioside（STV）在内的以甜菊醇为母核的所有甜菊糖苷都已被允许作为低热量、高倍甜味剂应用于食品加工业[5]。此外，甜菊糖苷类化合物还广泛用作香精、医药中间体、化妆品和植物生长调节剂[6-7]。当前，甜叶菊人工种植及提取加工的主要目的之一在于获取其叶片中富含的甜菊糖苷，甜叶菊叶片的应用和市场价值受其各甜菊糖苷的绝对和相对含量影响，因此甜菊糖苷提取用甜叶菊优良新品种的选育就显得尤为重要。

为选育甜菊糖苷提取用甜叶菊优良品种，有必要对甜叶菊种质叶片中各甜菊糖苷组分进行检测。高效液相法是目前甜菊糖苷检测普遍使用的方法[8]，样品检测前的除杂纯化对提高色谱柱分辨率和使用寿命、提高分析结果准确性具有决定性作用。而甜叶菊检测液中含有色素、鞣质、多酚等杂质，其总量可达甜菊糖苷的5～7倍或以上[2]，为此，有必要基于现有的甜叶菊种质甜菊糖苷高效液相检测方法建立一种快速简捷的样品纯化方法，以提高甜叶菊种质叶片中的各甜菊糖苷组分检测结果的灵敏度和准确性，为甜菊糖苷提取用甜叶菊优良新品种的选育提供技术支撑。

本研究在原有50%乙醇振荡过夜结合超声提取基础上[9]，通过比较不同吸附剂对甜叶菊叶片提取液中杂质和甜菊糖苷类化合物的吸附能力差异，实现对相关吸附剂的选择。在此基础上，进一步对相关吸附剂的具体使用方法进行深入探究，建立了一种适用于甜叶菊种质甜菊糖苷特性检测的样品前处理方法，为更方便快捷地开展甜叶菊种质甜菊糖苷特性评估提供技术支撑，促进甜叶菊优良新品种选育。

1 材料与方法

1.1 材料

所用甜叶菊（S.rebaudiana）叶片取自本实验室位于南京农业大学江浦农场的甜叶菊种苗繁育基地，参照罗庆云等方法[9]，改用含0.26%（v：v）浓氨水、50%（v：v）乙醇的水溶液准备高效液相检测用浸提液备用。

1.2 酸性Al2O3和碱性Al2O3的制备

酸性Al2O3的制备方法为：取氧化铝粉末40.0g，加入60.0mL 1%HCl（m：v）溶液中，充分振荡处理30min，用蒸馏水洗至pH 4.0，80℃烘干保存备用。碱性Al2O3的制备方法为：取氧化铝粉末40.0g，加入60.0mL 1%NaOH（m：v）溶液中，充分振荡处理30min，用蒸馏水洗至pH 10.0，80℃烘干保存备用。

1.3 有效处理方法分析

取1.1制备的高效液相检测用浸提液各0.50mL于2.0mL离心管中，分别设硅藻土0.04和0.08g添加、硅胶0.08和0.16g添加、活性炭0.10和0.20g添加、酸性氧化铝0.10和0.20g添加、碱性氧化铝0.10和0.20g添加、5%TCA（三氯乙酸）0.2mL添加和25%石灰乳0.2mL添加12种处理，室温振荡2h，12000r/min 4℃离心15min，取上清，0.22μm微孔滤膜过滤，4℃冰箱保存备检。同时设未添加吸附剂的空白对照，重复3次。

1.4 酸性Al2O3最佳用量分析

取1.1所制备的高效液相检测用浸提液各0.50mL于2.0mL离心管中，分别加入酸性Al2O30.025g，0.05g，0.10g，0.20g，0.30g，0.40g，0.50g， 室温振荡吸附处理 12h， 12000r/min 4℃离心 15min， 取上清，0.22μm微孔滤膜过滤，4℃冰箱保存备检。同时设未添加酸性Al2O3吸附剂的空白对照，每个处理重复3次。

1.5 酸性Al2O3最佳吸附时间分析

取1.1所制备的高效液相检测用浸提液各0.50mL于2.0mL离心管中，加入酸性Al2O30.10g室温下分别振荡吸附处理 5min、15min、30min、1h、2h、4h 和 8h，4℃下 12000r/min 离心 15min，取上清 0.22μm 微孔滤膜过滤-20℃冰箱保存备检。同时设未添加酸性Al2O3吸附剂的空白对照和添加0.10g酸性Al2O3混匀后迅速离心分离的处理对照（0min），每个处理重复3次。

1.6 试验

1.6.1 精密度试验 取1.1所制备的高效液相检测用浸提液各0.50mL于2.0mL离心管中，加入酸性Al2O30.10g室温下分别振荡吸附处理30min，4℃下12000r/min离心15min，取上清0.22μm微孔滤膜过滤，在相同色谱条件下连续进样检测6次。

1.6.2 稳定性试验 按1.6.1方法准备检测液1份，分别于0h，1h，2h，4h，8h，12h，24h各检测3次。同时跟踪检测未添加酸性Al2O3吸附剂的空白对照。

1.6.3 重复性试验 同样按1.6.1方法分别准备检测液平行样5份，各检测3次。

1.7 实用性验证

为探讨酸性Al2O3吸附去除甜叶菊提取液中非甜菊糖苷类杂质的适宜使用方法，本研究进一步依1.6.1方法设用含 0.26%（v：v）浓氨水、50%（v：v）乙醇的水溶液浸提后加入 1/5（m：v）酸性 Al2O3吸附处理 30min（以下简称“后吸附法”）、参照罗庆云等方法[9]但甜叶菊叶片样品加入含0.26%（v：v）浓氨水、50%（v：v）乙醇的水溶液中时同步加入1/5（m：v）酸性Al2O3室温振荡过夜超声提取（以下简称“同步吸附法”）等两种应用方案。同时设未添加酸性Al2O3吸附剂的空白对照，每个处理重复3次。

1.8 样品的检测及数据处理

参照JECFA（2010）[10]方法检测各样品RA、STV及RC含量。在数据的前期处理中以RA和STV的总量作为甜菊糖苷含量指标，以保留时间早于RA的化合物总量作为非甜菊糖苷类化合物含量指标。利用Excel（2007）处理各检测数据和制图。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式对检测液杂质及甜菊糖苷检出量的影响

由于甜叶菊叶片除富含甜菊糖苷外，还含有色素、鞣质、多酚、多糖、树胶、粗纤维、蛋白质和矿质元素等非目标分析物，这些化合物的存在会增加色谱柱的分离负担、降低柱效和工作效率。

在植物提取液和污水净化处理中，硅藻土可用于去除小颗粒固型杂质，活性炭可以去除色素，氧化铝可用于去除酚类等色素物质，三氯乙酸可用于去除大分子蛋白质，石灰乳可去除金属阳离子。为此，本研究先对上述化合物在甜叶菊种质甜菊糖苷特性检测用样品前处理中的应用潜力进行了比较研究。

图1 各处理对样品中杂质及RA和STV总量的影响

由图1可以看出，不同化合物的添加对检测液中非糖苷类杂质和以RA和STV为代表的甜菊糖苷含量的影响不同，其中硅藻土、活性炭、碱性氧化铝、TCA和石灰乳的加入都或多或少地使检测液中的杂质和甜菊糖苷同步减少，表明这些化合物对非糖苷杂质和甜菊糖苷选择性较小，不适用于本研究所需高效液相检测液的去杂前处理。与上述化合物不同的是，在本研究所涉及的化合物中，硅胶和酸性氧化铝对非糖苷类杂质和甜菊糖苷表现出一定的选择性，其中酸性氧化铝的添加可将杂质降低到原液的20%左右 （酸性氧化铝0.1g添加时，杂质检出量为原液20.8%±3.7%；0.2g添加时，杂质检出量为原液18.6%±0.8%），而对检测液中以RA和STV为代表的甜菊糖苷含量的影响相对较小 （酸性氧化铝0.1g添加时，RA和STV为代表的甜菊糖苷检出量为原液86.6%±3.5%；0.2g添加时，检出量为原液82.7%±0.8%）。表明酸性Al2O3可以作为高效液相检测液去杂前处理用化合物，但随着酸性Al2O3用量的增加，甜菊糖苷检出量减少明显，为此，有必要对酸性Al2O3的适宜用量进行进一步研究。

2.2 酸性Al2O3最适用量探究

由图 2的 A，不同用量酸性 Al2O3处理 12h 时，随酸性 Al2O3用量由 0.025g（1/20（m：v））增加至 0.1g（1/5（m：v））时，检测液中杂质检出量从对照的70.0%±10.0%迅速减少为对照的32.9%±0.96%。与此同时，检测液中以RA和STV为代表的甜菊糖苷检出量保持基本稳定，都为对照的98.0%左右。但，随着酸性Al2O3用量的进一步加大增加，以RA和STV为代表的甜菊糖苷检出量逐渐减少至对照的86%左右，而杂质检出量却基本稳定在对照的36.0%左右。上述结果表明，当酸性Al2O3的用量为0.10g/0.5mL（1/5（m：v））时，糖苷检出率的减少量（相对变化率为对照的97.1%±0.6%）远小于杂质检出率的相对变化率（为对照的32.9%±1.0%），也较其他处理水平表现出更好的工作效率。

图2 不同量酸性Al2O3吸附处理12h（A）、1/5（m：v）酸性Al2O3吸附不同时间（B）对样品中杂质及RA和STV总量的影响

2.3 酸性Al2O3最佳处理时间探究

在实际样品前处理中，适宜处理时间对于合理安排实验进程，提高工作效率具有非常重要的意义，为此，在前述2.2研究基础上，本部分对酸性Al2O3的适宜处理时间进行了研究。

由图2的B可以看出，在相同用量下[0.10g/0.5mL（1/5（m：v））]，酸性Al2O3对非糖苷类化合物表现出快速的吸附去除能力，酸性Al2O3的加入可使杂质检出量迅速减少到对照的40.3%±0.3%，但处理时间大于15min时，杂质检出量就不再减少；同时，各处理间以RA和STV为代表的甜菊糖苷检出量变化很小。为此，在实际应用中，可以考虑将酸性Al2O3的处理时间设置为15～30min。

2.4 酸性Al2O3处理方法的精密度、稳定性和重复性验证

为确定酸性Al2O3的加入除对高效液相检测液中非糖苷类化合物吸附去除外，是否会对后续的糖苷类化合物及未吸附去除部分杂质的检测产生影响，本研究进一步对酸性Al2O3处理样品液各组分检出量的精密度、稳定性和重复性进行了验证。

表1结果揭示，酸性Al2O3处理样品液中包括非糖苷类化合物、RA、STV和RC在内的各组分检出精密度、稳定性和重复性所对应的相对标准偏差（RSD）都小于1.0%，表明酸性Al2O3处理后检测液中各组分能够保持良好的稳定性，说明酸性Al2O3可用于甜叶菊叶片含0.26%（v∶v）浓氨水、50%（v：v）乙醇的水溶液提取液高效液相检测样品前处理。

2.5 酸性Al2O3应用方式的实用性验证

在前述研究中采取的工作策略为先进行50%乙醇振荡过夜结合超声提取离心收集后再对上清液进行酸性Al2O3处理，之后还需要再次离心去除酸性Al2O3后才可以微孔滤膜过滤上样检测，在整个过程中涉及两次离心操作。由于实际育种评价中检测所涉样品量大，若能减少样品处理步骤、降低样品准备工作量，对于实验室检测工作将具有非常重要的实践意义。

表1 精密度、重复性和稳定性结果

为此，前述“后吸附法”与“同步吸附法”等两种酸性Al2O3添加处理方法对检测液中非糖苷类化合物及以RA和STV为代表的甜菊糖苷检出量的影响情况进行了比较。图3结果表明，“后吸附法”与“同步吸附法”等两种酸性Al2O3添加处理方式对非糖苷类化合物和以RA和STV为代表的甜菊糖苷的检出量影响不大，处理间差异不显著。为此，在实际应用中可以采用“同步吸附法”，以减少离心操作次数，提高工作效率。

图3 酸性Al2O3两种添加方式对样品中杂质及RA和STV总量的影响

3 讨论和结论

植物类样品化学成分复杂，为降低后续检测压力，需要对样品进行包括净化在内的前处理。目前常用的方法包括液液萃取、固相萃取（SPE）[11]等步骤，但存在处理效率低，操作繁琐，且在实际操作中由于存在容器之间的转移等步骤，系统和人为误差大，为此，在本研究中不予考察。

现有研究结果表明，活性氧化铝和硅胶对亲水性色素的吸附效果好[12-13]，活性炭和硅藻土可以用于亲脂性色素的吸附[14]，TCA有助于蛋白质的沉淀[15]，石灰乳可螯合沉淀去除部分矿质元素。有鉴于此，本研究就这些化合物对甜叶菊提取液中非糖苷类杂质和以RA和STV为代表的甜菊糖苷的选择吸附特性首先进行了初步评估，结果表明硅藻土、活性炭、碱性氧化铝、TCA和石灰乳对非糖苷类化合物和甜菊糖苷的选择性较小，而硅胶和酸性氧化铝表现出一定的选择性，并以酸性氧化铝对非糖苷类化合物的选择性吸附效果最好。

进一步的分析表明，酸性氧化铝处理对包括非糖苷类化合物、RA、STV和RC在内的各组分检出精密度、稳定性和重复性所对应的相对标准偏差（RSD）都小于1.0%。且在实际育种检测中，可采用“同步吸附法”，以减少操作步骤，提高工作效率。

结合本实验室前期研究结果，经本研究进一步优化的甜叶菊叶片甜菊糖苷特性分析用样品前处理工作方案为：甜叶菊叶片取样后80℃烘干过夜，研磨过60目筛，精密称取于离心管中，加入6倍（m：m）酸性Al2O3和 30 倍（v：m）含 0.26%（v：v）浓氨水及 50%（v：v）乙醇的水溶液，室温震荡过夜，40℃超声处理（功率 250W，频率40kHz）60min，10000r/min离心10min后取上清，0.22μm有机相微孔滤膜过滤后4℃保存备检。

另外，也可以采用本研究前期实验中所利用的方案——“后吸附法”，即在甜叶菊叶片用30倍（v：m）含0.26%（v：v）及 50%（v：v）乙醇的水溶液提取所得的提取液中加入 1/5（m：v）酸性 Al2O3，40r/min 室温振荡处理30min，10000r/min离心10min后取上清，0.22μm有机相微孔滤膜过滤后4℃保存备检。

经上述两种方法处理后，可使提取液中非糖苷类化合物检出量都减少65.0%以上，而对以RA和STV为代表的甜菊糖苷检出量影响小于3.0%。

为此，本研究在原有50%乙醇振荡过夜结合超声提取[9]基础上，通过比较不同吸附剂对甜叶菊提取液中非糖苷类化合物及甜菊糖类吸附能力差异，建立了一种适用于甜叶菊种质甜菊糖苷特性检测的样品前处理方法，为更方便快捷地开展甜叶菊种质中甜菊糖苷特性的评估提供了技术支撑，必将有力地促进甜叶菊优良新品种选育。

致谢：实验由罗庆云和李小燕共同设计，由李小燕在罗庆云的指导下负责实验的具体操作、数据采集及初稿撰写，罗庆云负责图表制作及定稿撰写，邓瑞欣、王甜甜对论文的修改提出参考意见，李小燕、邓瑞欣、王甜甜、叶杨潇、尚进、李宁、叶青霞等参与实验材料繁育，陈爱彦和刘福凤负责实验材料田间管理。

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Acid Aluminium Oxide Used in Stevia Sample Pretreatment for Steviol Glycosides Analysis

LUO Qing-yun*,LI Xiao-yan*,DENG Rui-xin,WANG Tian-tian,YE Yang-xiao,SHANG Jin
（College of Horticulture,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,Jiangsu）

To promote the selection and breeding of new stevia lines for steviol glycosides （SGs）extraction,detection quantity of non-glycosides and SGs were employed as indicators to compare the feasibility of adsorbents used in the stevia sample pretreatment for SGs detection by high performance liquid chromatography （HPLC）.The results showed that,compared to the other adsorbents those addition to the extraction solution,acid Al2O3can remove most of the non-glycoside impurities in the leaching solution and，on the same time,take rebaudioside A（RA）and stevioside （STV）as representative of SGs,only a very slight impact were caused on the contents of SGs.Further analysis revealed that,the optimum pretreatment scheme for the HPLC detection SGs in the 50%ethanol extract of stevia leaves by using of acid Al2O3was as follows:After adding 1/5 （m:v）acid Al2O3to the 50%ethanol extract of stevia leaves,oscillation at 40 r/min under room temperature for 30 min.Pretreatment by above method,the detection quantity of non-glycoside impurities can be reduced by more than 65.0%,and those of SGs,take rebaudioside A and stevioside as representative,were impacted less than 3.0%.

stevia;steviol glycosides;HPLC;sample pretreatment

S566.9

A

1007－2624（2017）06－0013－05

10.13570/j.cnki.scc.2017.06.004

*两作者对该文的贡献相同

2017-06-08

国家自然科学基金面上项目：基于转录组测序的甜叶菊Rebaudioside A生物合成关键基因优异单倍型挖掘（31471553）。

罗庆云（1974-），男，重庆垫江人，博士，讲师。研究方向：植物次生代谢生理与遗传。E-mail：qyluo@njau.edu.cn