尧人山国家森林公园虫生真菌资源初步调查

周家喜+邹晓+周叶鸣

摘要：于2015年9月对贵州省尧人山国家森林公园虫生真菌资源进行初步调查，共采集16个标本，基于ITS1-5.8S-ITS2 rDNA 基因序列，对采集标本分离菌株进行培养鉴定。结果发现，标本分属3科7属10种，主要有白僵菌属、棒束孢属、蜡蚧菌属、线性虫草属、被毛包属、多头霉属、枝穗霉属，其中白僵菌属为优势属，寄主以鳞翅目昆虫为主。调查结果为该地区虫生真菌资源的分布、多样性和利用提供了参考。

关键词：虫生真菌；资源调查；分类鉴定；尧人山国家森林公园；寄主；多样性；标本统计；分子鉴定

中图分类号： Q-9 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0244-05

收稿日期：2016-04-21

基金项目：国家自然科学基金（编号：31360031）；国家自然科学基金重大项目（编号：31093440）；贵州省农业科技攻关项目（编号：黔科合NY[2013]3034）。

作者简介：周家喜（1990—），男，云南保山人，硕士研究生，主要从事微生物生态学研究。E-mail：1552047449@qq.com。

通信作者：邹 晓，博士，教授，主要从事真菌资源与利用及生态学研究。E-mail：coprinus@126.com。 虫生真菌指一类能寄生在寄主体内和体表的真菌，包括引起寄主致死的昆虫病原真菌如白僵菌，专性寄生昆虫体表降低寄主活力的虫寄生菌如虫囊菌，与各种昆虫共生的共生菌如多毛菌[1]，寄生在线虫、变形虫、轮虫等小动物上的捕食性真菌如捕食线虫性真菌Duddingtonia flagran[2]。虫生真菌寄主范围较广，除多种昆虫外，还包括蜘蛛、螨类、线虫、轮虫、蜈蚣等多种动物[3]。

自然界中虫生真菌资源极为丰富，广泛分布于壶菌门、子囊菌门、接合菌门、担子菌门、半知菌门等各个亚门中[4]。据不完全统计，目前世界上报道的虫生真菌约有100多个属800多种[2]。我国虫生真菌资源也很丰富，已发现记载的昆虫病原真菌涉及40多个属400多种[5]，其中捕食和寄生线虫真菌140种，虫草属真菌120种[6-7]。虫生真菌与人类生活关系密切，涉及食用、药用、生防等多个方面。在古代，我国就曾有食用白僵蚕、冬虫夏草、蝉花等虫生真菌的记载[8]。研究发现，部分虫生真菌（蛹虫草、冬虫夏草、蝉花等）具有强肾、润肺、通精气及抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老、降血脂血糖、提高人体免疫力等药用功效[9-10]。由于虫生真菌种类多、安全有效、容易大量生产，所以在害虫防治、植物病害、杂草防治等生物防治方面可发挥重要作用[11]，常见的真菌杀虫剂有球孢白僵菌[12]、金龟子绿僵菌[13]、玫烟色拟青霉[14]、蜡蚧轮枝菌[15]、汤普生被毛孢[16]等。此外，虫生真菌还含有虫草多糖、虫草酸、腺苷等多种活性成分，在医药保健品、化妆品及其他领域用品的开发应用上具有很大潜力[17]。但由于虫生真菌分布十分广泛，不同生境条件下分离获得的同一种类的菌株间在数量和致病性上存在显著差异[18]。实践中，多数虫生真菌的产孢量、生长速度、活性产物的产生、毒力等方面存在差异，而且存在退化比较严重的现象[11]。因此，开展虫生真菌种类资源及分布研究，对发现新资源、开发新的生物制品及筛选高效生防菌具有十分重要的理论意义和应用价值。

尧人山国家森林公园位于贵州省黔南布依族苗族自治州三都水族自治县都柳江畔（107°53′～107°58′E、24°54′～25°59′N），海拔560～1 365 m，总面积5 718.5 hm2；公园内群山连绵，峰峦叠嶂，堪称“水乡绿海，黔南明珠”；气候温和湿润，属中亚热带季风气候，年平均温度为18 ℃，年降水量为 1 349.5 mm[19]。该区森林资源丰富，约有5/6的面积尚处于原始森林状态，森林覆盖率达90.87%，素有“百里林海”之称；园内生态环境稳定，林深树密，树种繁多，动物资源丰富，是野生动物的乐园[20]。公园特殊的生态环境和优越的气候条件，蕴藏着丰富的虫生真菌资源；丰富多样的植被，温暖湿潤的气候，为昆虫、蜘蛛、螨等节肢动物的生长、繁衍提供了场所和适宜的环境；湿暖的气候、茂密的植被和丰富的动物区系，为病原菌的流行提供了良好的条件。

笔者所在课题组于2015年9月对贵州省黔南布依族苗族自治州三都水族自治县尧人山国家森林公园虫生真菌资源进行初步调查，并根据ITS1-5.8S-ITS2系统发育及寄主分布分析其多样性，以期丰富当地的生物资源，为当地虫生真菌资源的开发利用和合理保护提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

PDA培养基：马铃薯20 g切块煮沸，过滤取液，葡萄糖 20 g，琼脂18 g，补水至1 L，121 ℃灭菌30 min。

1.2 调查方法

根据尧人山国家森林公园面积广、森林植被覆盖面大且受人为干扰程度低、山势陡峻、沟谷交错、水热充沛的特点，采用定点调查、沿路踏查、普查等方式，详细采集地表层、枯枝落叶及灌木丛中的虫生真菌，并在采集中记录虫生真菌生长环境情况和罹病个体数。

1.3 标本分离、鉴定

1.3.1 标本分离 先用自来水将标本虫体表面冲洗干净，再用无菌水冲洗标本3次，接着用75%乙醇表面消毒5 s。掰断虫体部分，用已灭菌的接种针挑取虫体断面组织块，接种到加有抗生素的PDA平板上，16 ℃培养30 d。挑取已分离得到的纯菌落接种于PDA试管斜面中进行保存。

1.3.2 DNA提取、扩增、测序 用接种针从PDA平板上挑取菌丝体，根据OMEGA试剂盒方法提取总DNA，并于-20 ℃保存。选用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS2（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[21]扩增ITS区的rRNA。反应体系25 μL：master mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，引物ITS1和ITS2均为1.0 μL，DNA模板2.0 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次；最后72 ℃延伸 10 min，扩增产物送往上海的美国英杰生命技术有限公司纯化测序并获取序列。endprint

1.3.3 分子鉴定 将得到的ITS序列提交GenBank的Blast程序进行比对，下载相似性大于93%的序列及其相关近缘属菌株的ITS序列，首先用MEGA 5.2对序列进行比对剪切，然后通过最大似然法（ML），运行1 000次Bootstrap验证，构建系统发育树[22]。

1.4 寄主多样性分析

将采集到的罹病个体按寄主属性进行分类整理，根据寄主的丰富度及种类分析虫生真菌的多样性及分布情况。

1.5 多样性指数分析

采用辛普森指数（Simpson）、香农-威纳指数（Shannon-Wiener）及均匀度指数（Pielou）研究分析尧人山国家森林公园虫生真菌的多样性[23]。

Simpson指数：D=1-∑Pi2。

式中：Pi为种的个体数占群落中总个体数的比例，Pi=ni/N，ni为第i种的个体数，N为所有种的个体数。

Shannon-wiener指数：H′=-∑PilnPi；

Pielou均匀度指数：E=H′/Hmax。

式中：H′为实际观察的物种多样性指数；Hmax为最大的物种多样性指数，Hmax=lnS，S为群落中的总物种数。

2 结果与分析

2.1 虫生真菌标本统计

本次调查共采集到虫生真菌罹病个体16个（图1），并获得其分离菌株16株，详细信息见表1。

2.2 虫生真菌初步鉴定

对于采集的标本，通过形态学比较，初步鉴定全为肉座菌目真菌，分属3科7属10种（表2、表3）。数量最多的一科为虫草菌科，占总数的62.50%，包括棒束孢属2种、蜡蚧菌属1种、白僵菌属2种；其次是线性虫草菌科，占总数的31.25%，包括被毛孢属1种、多头霉属1种、线性虫草属2种；最少的一科为生赤壳科，占总数的6.25%，只有枝穗霉属1种。若以样本数超过4为优势属，那么该地区虫生真菌优势属为白僵菌属，占总数的31.25%，主要为球孢白僵菌；其次是棒束孢属，约占25.00%，主要有细脚棒束孢和环链棒束孢。

2.3 虫生真菌分子鉴定

在虫生真菌分离菌株DNA构建的ITS1-5.8S-ITS2系统发育树中，所有试用序列明显分为7个不同分支，分别是棒束孢类、蜡蚧菌类、白僵菌类、被毛孢类、多头霉类、枝穗霉类、线性虫草类。菌株GZUIFR-SD03、GZUIFR-SD05、GZUIFR-SD06、GZUIFR-SD08、GZUIFR-SD13与球孢白僵菌（JX110371、HQ444271、KM249039、KT280276）和布氏白僵菌（LN886699）聚在白僵菌属分支中。菌株GZUIFR-SD01、GZUIFR-SD02、GZUIFR-SD04、GZUIFR-SD09与细脚棒束孢（GU194179）、环链棒束孢（JQ425656）等聚在棒束孢属分支中。菌株GZUIFR-SD15与刀孢蜡蚧菌（EU918702）、丝枝蜡蚧霉（JX241644）等聚在蜡蚧菌属分支中。菌株GZUIFR-SD11与中国多头霉（NR119928）、P. tomentosus（KF049666）等聚在多头霉属分支中。菌株GZUIFR-SD07与瘤状被毛孢（EF194146）、鹿儿岛被毛孢（KM652172）等一起聚在被毛孢属分支中。菌株GZUIFR-SD10与粉红粘帚霉（KT387608）、罗杰斯无性穗霉（KC806290）等聚在枝穗霉属分支中。菌株GZUIFR-SD14与蚁窝线虫草（AB222679）聚在一起，菌株GZUIFR-SD12和GZUIFR-SD16与蜂头线虫草（JN943351）聚在一起，均属于线性虫草属分支。该结果与初步形态鉴定结果一致，从分子水平表明尧人山国家森林公园虫生真菌种类丰富（图2）。

2.4 虫生真菌寄主多样性分析

根据本次调查结果可知，该区虫生真菌寄主种类多、范围广（表4）。如图3所示，包括鳞翅目、膜翅目、同翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫及蜘蛛等多种动物。其中，鳞翅目昆虫最多，占37.50%，主要有鳞翅目幼虫和蛹、毛虫、刺蛾幼虫等；其次是膜翅目和同翅目，均占18.75%，膜翅目主要包括蜂和蚂蚁等，同翅目包括蝉和蝽；寄主为蜘蛛的占12.50%；最少的为鞘翅目和双翅目，各占6.25%，发现的鞘翅目主要为瓢

虫，双翅目主要是苍蝇。结果表明，尧人山国家森林公园虫生真菌资源丰富，广泛分布于昆虫、蜘蛛等多种节肢动物上。

2.5 多样性分析

从表4中可以看出，尧人山虫生真菌群落多样性偏低（D=0.79，H′=1.84），均匀度较高（E=0.95）。寄主多样性同样偏低（D=0.77，H′=1.61），均匀指数较真菌群落均匀指数低（E=0.88）。

3 结论与讨论

尧人山国家森林公园虫生真菌资源丰富多样，分布广泛，初步调查研究发现包括3科8属10种，分别是虫草菌科（棒束孢属、白僵菌属、蜡蚧菌属）、线性虫草菌科（多头霉属、被毛孢属、线性虫草属）、生赤壳科（枝穗霉属）。其中，白僵菌属为优势属，球孢白僵菌为主要种群。

关于贵州地区虫生真菌資源调查已有报道，该地区的虫生真菌种类十分丰富，虫草属为优势属，但在本次调查中却没有发现，而尧人山优势属白僵菌属却是贵州的广布属，广泛分布于贵阳、湄潭、遵义及梵净山等地[24-28]。此外，枝穗霉及部分线性虫草在以上保护区却少有发现。这可能与虫生真菌的发生与温湿度环境及寄主有关，虫草属和线性虫草属真菌多发生于高湿的阔叶林环境且对寄主专一（少为广谱），导致这部分真菌发生量减少且零星分布，调查难度增大，而白僵菌属可寄生多种昆虫，分布广泛，容易调查。

在自然环境中，虫生真菌的繁衍、分布与气候环境、土壤性质、动植被丰富度、海拔高度、人类活动以及历史环境变迁等有关[29]。尧人山地区植被丰富，鳞翅目、双翅目、同翅目、鞘翅目、蜘蛛等节肢动物广泛分布于原始森林中，其中鳞翅目昆虫分布最广，丰富多样的动物资源为该地区复杂的病原真菌附着提供了场所和营养条件。季风气候显著，环境温和湿润，大大提高了该地区病原真菌的寄生率和存活率。此次调查结果显示，该区虫生真菌多样性指数偏低，均匀度较高，这可能与本次获得标本数较少有关。尧人山国家森林公园虫生真菌的调查，丰富了当地的生物资源，为该地区虫生真菌资源的分布、多样性研究及开发利用提供了有益参考。endprint

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