中药川贝母对哮喘模型小鼠MMP2，MMP9和TIMP1的影响
2017-11-17李厚忠高照渝黄伟任公平徐红纳张欣付惠张羽飞
李厚忠 高照渝 黄伟 任公平 徐红纳 张欣 付惠 张羽飞
[摘要]觀察中药川贝母对哮喘模型小鼠气道重塑及基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）与基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）的影响，探讨其治疗哮喘的作用机制。BALB/C小鼠，随机分为正常组、模型组、高剂量组、低剂量组、阳性对照组。除正常组外，其他各组用卵蛋白（OVA）建立哮喘小鼠模型。造模成功后高剂量组和低剂量组分别按180，90 mg·kg-1剂量给予中药川贝母灌胃；阳性对照组于腹腔注射05 mg·kg-1剂量地塞米松；正常组和模型组等量生理盐水灌胃，每天1次，连续28 d。观察各组小鼠气道反应性的变化，支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数和白细胞分类的变化以及支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度的变化；ELISA法检测MMP2，MMP9，TIMP1水平；RTPCR检测MMP2，MMP9，TIMP1 mRNA的表达。结果显示，模型组气道反应性、BALF中细胞总数以及中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数、支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度明显高于正常组（P<001），高剂量组和低剂量组与阳性对照组则明显低于模型组（P<005或P<001）；模型组MMP2，MMP9和TIMP1水平和mRNA表达明显高于正常组（P<001），高剂量组和低剂量组与阳性对照组则明显低于模型组，差异具有统计学意义（P<001）。推断中药川贝母可改善哮喘模型小鼠气道重塑状态，其机制可能与其降低MMP2，MMP9和TIMP1有关。
[关键词]川贝母； 哮喘； 基质金属蛋白酶2； 基质金属蛋白酶9； 基质金属蛋白酶组织抑制剂1
[Abstract]To investigate the effects of Fritillariae Cirrhosae Bulbus on airway remodeling and matrix metalloproteinase2（MMP2）， matrix metalloproteinase9（MMP9）， tissue inhibitor1 of metalloproteinase（TIMP1） of a murine asthma model， and explore its mechanism in treatment of asthma BALB/C murines were randomly divided into the normal group， model group， high dose group， low dose group， and positive control group Except for the normal group， all the other groups received ovalbumin（OVA） to establish murine asthma model After successful modeling， the murines in high dose group and low dose group were orally administered with Fritillariae Cirrhosae Bulbus powder at the dose of 180 mg·kg-1 and 90 mg·kg-1， respectively； the murines in positive control group were injected intraperitoneally with dexamethasone at the dose of 05 mg·kg-1； while the murines in normal group and the model group were orally administered with the same volume of normal saline All the drugs were given to murines per day for 28 d The variations of airway responsiveness， variations of the total cell count and leukocyte differential count in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）， and the variations of thicknesses of bronchial wall and airway smooth muscle of each group were observed The levels of MMP2， MMP9 and TIMP1 were measured by ELISA； and the expression levels of MMP2， MMP9 and TIMP1 mRNA were detected by RTPCR The results showed that as compared with the normal group， the airway responsiveness， the count of total cells， neutrophils， macrophage， lymphocytes， eosinophils in BALF， and the thicknesses of bronchial wall and airway smooth muscle were increased significantly in the model group（P<001）； as compared with the model group， the above indicators were decreased significantly in the high dose group， low dose group and positive control group （P<005 or P<001） As compared with the normal group， the levels and expressions of MMP2， MMP9 and TIMP1 mRNA were increased significantly in the model group（P<001）； while as compared with the model group， these levels were decreased significantly in the high dose group， low dose group and positive control group（P<001） In conclusion， Fritillariae Cirrhosae Bulbus can improve airway remodeling in a murine asthma model， and its mechanisms may be related to downregulating MMP2， MMP9 and TIMP1 levels.endprint
[Key words]Fritillariae Cirrhosae Bulbus； asthma； matrix metalloproteinase2； matrix metalloproteinase9； tissue inhibitor1 of metalloproteinase
支气管哮喘（简称哮喘）是全球范圍内威胁公众健康的最常见慢性呼吸道疾病，发病机制复杂，至今尚未完全明确，近年发病率呈上升趋势，尤其在儿童[1]。目前临床上常用的药物，如糖皮质激素、白三烯受体拮抗药等，能迅速控住气道炎症，效果良好，但是仍然存在一些弊端，如停药后的复发，长期用药导致全身或局部的不良反应等[23]，而中医药在哮喘的治疗方面历来有其独特的优势。川贝母是具有代表性的川产道地名贵药材，为临床常用中药，其性苦、甘，微寒，有化痰止咳、清热散结、润肺之功效，多用于热痰、燥痰、肺虚劳嗽、久嗽、痰少咽燥、痰中带血等[4]。前期实验表明，川贝母可有效降低哮喘模型小鼠一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、丙二醛（MDA）、白细胞介素1（IL1）、白细胞介素6（IL6）水平，升高超氧化物歧化酶（SOD）活力等，同时也降低哮喘模型小鼠血管内皮生长因子（VEGF）和缺氧诱导因子1α（HIF1α）的表达，且呈一定的量效关系[57]。本研究旨在前期研究基础上，继续探讨观察中药川贝母对哮喘模型小鼠气道反应性、气道炎症及气道重塑的影响，为阐明可能作用机制，本研究还观察了其对基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）与基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）的影响。
1材料
11动物雌性BALB/C小鼠60只，6～8周龄，由哈尔滨医科大学动物实验中心提供，实验动物合格证号SCXK（黑）2015001，实验动物使用许可证号SYXK（黑）2015007。空调恒温室内22 ℃，相对湿度50%，自由饮水饮食，通风换气20次/h，适应性饲养1周。
12仪器与试剂微量加样器（3112）由德国eppendorf生产；自动平衡离心机（LDZ52）由北京京立离心机有限公司生产；电子天平（UW820S）由日本岛津生产；超声雾化器（402A）由江苏鱼跃医疗设备股份有限公司生产；光学显微镜（BH2）由日本Olympus 公司生产；粉碎机组（Fz400）由天津市茂源制药机械有限公司生产；卵蛋白（OVA）由美国Sigma 公司生产（货号ZY10652）；地塞米松磷酸钠注射液由白云山天星制药股份有限公司生产（批号160503）；MMP2，MMP9和TIMP1测试盒由美国ADL公司生产（货号分别为27631，25511和21091）。其他试剂均为国产或进口分析纯。
13中药川贝母粉的制备选取整齐、粉性足者川贝母（由牡丹江医学院附属红旗医院中药房提供，经牡丹江医学院医药研究中心初彦辉教授鉴定均符合2015年版《中国药典》要求）。用洁净的纱布擦拭药材表面以去除药材表面的灰尘。净选后的川贝母通过灭菌消毒窗消毒15 min后直接转至粉碎车间，用Fz400型粉碎机组加工成100目细粉，收得的细粉装入洁净的容器中，封口。全部加工完后的细粉用洁净的塑料袋分装成每袋1 kg备用。临用时，参照唐德才等主编的《中药学》所载成人所用剂量为3～6 g·d-1，根据动物体表面积等效剂量计算方法，计算小鼠给药剂量180 mg·kg-1为高剂量组，90 mg·kg-1为低剂量组。分别称取川贝母粉18，9 mg各溶于生理盐水5 mL制成混悬液，现用现配。
2方法
21模型建立健康清洁级BALB/C小鼠50只，腹腔内注射02 mg OVA+1 mg 氢氧化铝粉末制成的混悬液02 mL作为首次致敏，第15天将小鼠依次置于超声雾化器中，用1%OVA生理盐水喷雾激发小鼠哮喘发作，隔日1次，每次20 min，共激发10 d。以小鼠出现口唇发绀、腹肌痉挛、呼吸加快、点头呼吸或站立不稳等表现表示成功激发。共制备成功40只。
22分组及给药将成功制备的哮喘模型小鼠随机分为：模型组、高剂量组、低剂量组、阳性对照组，每组10只；另设正常组（10只以生理盐水代替OVA进行腹腔注射及雾化吸入）。正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃；高、低剂量组分别按照180，90 mg·kg-1剂量给予川贝母粉混悬液06 mL灌胃；阳性对照组于腹腔注射05 mg·kg-1剂量地塞米松。每天1次，连续28 d。
23气道反应性测定最后1次给药2 h后，采用美国Buxco公司的无创肺功能仪检测各组小鼠增强呼气间歇（Penh）。将小鼠置于体描箱内，适应5 min。使用不同质量浓度（依次为000，3125，625，1250，2500，5000 g·L-1）的乙酰甲胆碱（Mch）进行支气管激发，观察不同浓度的Mch激发下Penh的变化情况，比较各组小鼠气道反应性的改变。Penh=[（呼气时间/松弛时间）-1]×（最大呼吸流量/最大吸气量）。
24支气管肺泡灌洗液（BALF）总细胞及白细胞分类计数气道反应性测定结束24 h后，各组小鼠用1%巴比妥钠麻醉，剪掉颈部毛发后剪开皮肤，分离气管周围的组织，气管作一横行切口，插入气管插管。结扎右主支气管，经气管插管以10 mL生理盐水分3次灌洗左肺后，回收的BALF经2 000 r·min-1离心15 min，弃上清液，取沉渣经生理盐水重悬，吸取少量细胞悬液置血细胞计数板下计数细胞总数。DiffQuik染色液染色BALF细胞涂片后，作细胞分类计数。切取右支气管平滑肌固定于10%的中性福尔马林中，用于支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度测量。切取右肺门部位组织用于ELISA和RTPCR分析。
25支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度测量将右支气管平滑肌组织10%中性福尔马林固定后，常规乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察。采用ImagePro Plus 60图像分析软件分别测量肺内支气管基底膜周径（Pbm）、支气管总面积（Wat），支气管平滑肌面积（Wam），以Pbm标准化。支气管管壁厚度=Wat/Pbm，支气管平滑肌厚度=Wam/Pbm。endprint
26肺组织MMP2，MMP9和TIMP1水平测定取约1/2右肺匀浆，采用ELISA测定肺组织MMP2，MMP9和TIMP1水平，严格按照ELISA试剂盒的操作说明进行操作。
27RTPCR分析肺组织MMP2，MMP9和TIMP1 mRNA转录水平Trizol试剂提取剩余右肺组织总RNA，检测RNA纯度，按照RTPCR试剂盒进行反转录反应，合成单链的cDNA。cDNA 产物保存在-20 ℃。利用Pubmed查找相关基因序列，并利用引物合成软件Primer Premier 50设计引物。RTPCR 反应体系：体积为25 μL；反应程序为95 ℃变性45 s，60 ℃复性60 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环，72 ℃再延伸7 min。每个样本以内参基因βactin调整。扩增产物在15%琼脂糖凝胶电泳后通过凝胶成像分析系统观察并保存图像。每份样品检测3次。引物序列见表1。
28统计学方法采用SPSS 170软件进行描述性统计。计量资料用±s表示。多组间均数比较，采用Oneway ANOWA分析，组间两两比较，采用SNK法，当P<005为差异有统计学意义。
3结果
31川贝母对哮喘模型小鼠气道反应性的影响与正常组比较，模型组小鼠在吸入各浓度Mch时Penh均显著升高（P<001），并且此差異具有浓度依赖性；与模型组比较，高、低剂量组与阳性对照组小鼠各浓度Mch时Penh均显著降低（P<005或P<001），见表2。
32川贝母对哮喘模型小鼠BALF总细胞及分类细胞计数的影响与正常组比较，模型组小鼠BALF总细胞数及中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数均显著升高（P<001）；与模型组比较，高、低剂量组与阳性对照组小鼠BALF总细胞数及中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞计数均显著降低（P<005或P<001），见表3。
33川贝母对哮喘模型小鼠支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度的影响HE染色结果显示，正常组小鼠支气管壁完整，平滑肌呈正常厚度，支气管黏膜平整，细胞排列整齐；模型组小鼠基层细胞增生，排列紊乱，平滑肌增厚，支气管黏膜上皮脱落，水肿；高、低剂量组、阳性对照组小鼠支气管气管壁和平滑肌厚度降低，几乎接近正常对照组，见图1。与正常组比较，模型组小鼠支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度均显著增高（P<001）；与模型组比较，高、低剂量组与阳性对照组小鼠支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度均显著降低（P<005或P<001），见表4。
34川贝母对哮喘模型小鼠MMP2，MMP9和TIMP1水平的影响与正常组比较，模型组小鼠MMP2，MMP9和TIMP1水平均显著升高（P<001）；与模型组比较，高、低剂量组与阳性对照组小鼠MMP2，MMP9和TIMP1水平均显著降低
A正常组；B模型组；C高剂量组；D低剂量组；E阳性对照组（图2同）。
35川贝母对哮喘模型小鼠MMP2，MMP9和TIMP1 mRNA的影响与正常组比较，模型组小鼠MMP2，MMP9和TIMP1 mRNA均显著升高（P<001）；与模型组比较，高、低剂量组与阳性对照组小鼠MMP2，MMP9和TIMP1 mRNA显著降低（P<001），见图2和表6。
4讨论
哮喘是一种呼吸系统的常见的慢性炎症性疾病，其病理特点表现为气道炎症导致持续性气道高反应性及可逆性气流阻塞。而气道重塑是哮喘的重要特征，是引起气道发生气道高反应性及气流阻塞的重要机制之一，与哮喘的反复发作和迁延不愈密切相关。
气道的炎症是哮喘的特征性病理改变，包括多种炎性细胞参与，如中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞等[8]。动物实验研究表明，BALF
中存在大量的中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞是哮喘的典型特征[910]。当哮喘发作时，诱发了机体的免疫反应，引起中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞活化、向炎症部位趋化、聚集，从而释放炎性介质（如内皮素、血小板活化因子、白三烯、组胺等）间接或者直接损伤气道上皮细胞，引发气道炎症或气道高反应性[11]。故此，中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞也
称为哮喘的主要炎症效应细胞，与哮喘的严重程度呈正相关，是哮喘临床诊断最为重要的指标。本研究显示，模型组小鼠BALF中存在大量的中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞，与以往研究相一致，正常组小鼠BALF中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞较少；而高、低剂量组及阳性对照组小鼠BALF中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞均较模型组降低。以上结果提示，川贝母可有效抑制哮喘模型小鼠气道炎症反应，改善哮喘症状。
气道高反应性是发生发展过程中的重要因素，也是哮喘的重要特征之一，炎症细胞的激活及炎症介质的释放可以使气道反应性明显增高[12]。本研究采用肺功能仪检测各组小鼠Penh以反映气道高反应的程度，即Penh越高，气道反应性越高。本研究显示，模型组小鼠Penh均较正常组显著升高，提示模型组小鼠气道呈高反应状态；而高、低剂量组及阳性对照组小鼠Penh均较模型组降低。以上结果说明，川贝母可有效抑制哮喘模型小鼠气道高反应性，改善哮喘症状。
长期以来，有关于哮喘的发生机制，人们一直把重点放在气道炎症上，然而气道重塑在哮喘的发病过程中具有同样的重要作用。气道重塑以气道慢性炎症为发生基础，为炎症慢性发展的必然结果，被认为是哮喘防治的新靶点[13]。本研究显示，模型组小鼠气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度较正常组明显增加，提示模型组小鼠存在气道重塑；而高、低剂量组及阳性对照组小鼠气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度均较模型组减小。以上结果说明，川贝母可有效抑制哮喘模型小鼠气道重塑，改善哮喘症状。为探讨川贝母抑制哮喘模型小鼠气道重塑的可能机制，本研究对MMP2，MMP9和TIMP1进行了相关检测。endprint
能够引起哮喘气道重塑的介质种类较多，如血小板生长因子（PDGF），转移生长因子β家族（TGFβ）等，但是目前研究较多的是基质金属蛋白酶（MMPs）及其抑制剂（TIMPs）。MMPs是调节细胞外基质代谢的主要限速酶，因需要Ca2+，Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名，为一个大家族。MMPs家族中与哮喘关系最密切相关的有MMP2和MMP9，TIMP1是MMP2和MMP9的生理性抑制剂。MMP2和MMP9与TIMP1系统的失衡是引起细胞外基质降解和气道重塑的重要原因[1415]。MMP2和MMP9可有效降解IV型胶原，从而降解基底膜，促使嗜酸性粒细胞等炎症细胞气道内浸润，使气道平滑肌和周围组织改变发生气道重塑[16]。TIMP1通过与MMP2，MMP9的催化位点结合或与酶原的某些位点结合而抑制MMP2，MMP9活性，使细胞外基质降解减少，并使其降解产物在黏膜下层聚集，引起气道壁增厚，促使气道重塑的发生及进展，被认为是气道重塑的标志[17]。故此，调节MMP2，MMP9及TIMP1水平可能是抑制哮喘气道重塑的有效方法。本研究结果显示，模型组小鼠MMP2和MMP9水平及基因表达较正常组均升高，提示MMP2和MMP9可能参与哮喘气道重塑的形成过程，同时，模型组小鼠TIMP1水平及基因表达较正常组也升高，提示可能由于MMP2，MMP9的增高刺激TIMP1反应性增高，与以往研究结果相一致[18]。而高、低剂量组及阳性对照组小鼠MMP2，MMP9和TIMP1水平及基因表达均较模型组减小。以上结果说明，川贝母可能通过抑制MMP2，MMP9和TIMP1而抑制哮喘模型小鼠气道重塑。
综上所述，中药川贝母可有效降低哮喘模型小鼠的气道炎症反应和气道高反应性，同时也具有抑制气道重塑的作用，其機制可能与其抑制MMP2，MMP9和TIMP1有关。至于是否存在其他机制，如是否与转移生长因子β1（TGFβ1）有关，将继续探讨。
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[责任编辑张宁宁]endprint
