怀地黄块根中菊花心与非菊花心部位的化学质量特征比较

2017-11-17谢彩侠张苗李雅静耿晓桐王丰青张重义

中国中药杂志 2017年21期

谢彩侠　张苗　李雅静　耿晓桐　王丰青　张重义

[摘要]利用HPLC对怀地黄“北京1号”生育期内块根中菊花心、非菊花心及整体块根三部位中梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷进行含量测定，并结合其HPLC指纹图谱进行整体化学质量特征比较。结果表明，生育期内怀地黄主要成分含量变化趋势不同；各成分在菊花心与非菊花心部位富集量差别较大。梓醇、毛蕊花糖苷与地黄苷D在菊花心与非菊花心中的分布相对均匀，非菊花心部位地黄苷A的含量明显高于菊花心部位，而菊花心部位益母草苷的含量则明显高于非菊花心部位；地黄菊花心、非菊花心及整体块根3部位的HPLC指纹图谱色谱行为基本一致，但是化学成分含量相差较大；通过聚类分析，怀地黄菊花心部位与非菊花心部位、整体块根明显被分为2类。因此，怀地黄菊花心与非菊花心部位化学质量特征存在明显差异。该研究为怀地黄的质量评价和道地性的揭示提供依据。

[关键词]菊花心；化学成分；道地性； HPLC指纹图谱；主成分分析；聚类分析

[Abstract]An HPLC method was established to determine the contents of catalpol， acteoside， rehmaionoside A， rehmaionoside D， leonuride in three part of Rehmanni glutinosa in Beijing No1 variety R glutinosa during the growth period， This method， in combination with its HPLC fingerprint was used to evaluate its overall quality characteristicsThe results showed that：① the content of main components of R glutinosa varied in different growth stages ；② there was a great difference of the content of main components between theradial striations and the nonradial striations； ③ the two sections almost have the same content distribution of catalpol， acteoside and rehmaionoside D； ④the content of rehmaionoside A in nonradial striations was higher than that in radial striations，while the content of leonuride in radial striations was higher than that in nonradial striations； ⑤the HPLC fingerprint of radial striations， nonradial striations and whole root tuber were basically identical， except for the big difference in the content of chemical components The result of clustering displayed that the radial striations， nonradial striations， and whole root were divided into two groups In conclusion， there was a significant difference in the quality characteristics of radial striations and nonradial striations of R glutinosa This research provides a reference for quality evaluation and geoherbalism of R glutinosa.

[Key words]radial striations； chemical composition； geoherbalism； HPLC fingerprints； PCA； cluster analysis

地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch的新鲜或干燥块根，始载于《神农本草经》，被列为上品，为著名的“四大怀药”之一，被广泛应用于临床，对免疫、造血、心血管及神经系统均有显著疗效。

地黄在我国有悠久的药用历史，始栽于北魏时期，至今已有1 500多年的歷史[1]。明朝李时珍总结说：“今人惟以怀庆地黄为上，亦各处随时兴废不同尔”；另《本草从新》言：“以怀庆肥大而短，糯体细皮，菊花心者佳”[23]。清光绪26年（1900年），武陟年产地黄20万kg，该县地黄特点是横切面有“菊花心”，这是历代药商鉴定地道货的标志[4]。菊花心作为地黄道地药材标志性特征被大家所熟知，那么菊花心的存在与形成对地黄整体质量是否有一定的影响呢？现代研究发现，道地产区的怀地黄横切面有菊花心，同时有效成分梓醇的含量也都高于其他产区；怀地黄木质部所占面积越大，梓醇与毛蕊花糖苷含量越高，多糖的含量则越低；另外也有研究表明怀地黄皮部中梓醇和毛蕊花糖苷的含量比木质部的都要高[57]。以上研究仅仅对菊花心与非菊花心部位中的梓醇和毛蕊花糖苷2种有效成分在的含量差异进行分析，且研究结果不甚一致，也未能对怀地黄菊花心与非菊花心的质量特征做出整体评价。基于此，本研究以怀地黄“北京1号”品种为研究对象，分析生育期内地黄整体块根、菊花心及非菊花心中梓醇、毛蕊花糖苷、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D等指标性成分的动态变化，并结合其HPLC指纹图谱对其进行整体质量特征分析，为研究地黄菊花心与其质量的相关性和地黄道地性的揭示提供科学依据。endprint

1材料

11仪器

FW100型高速万能粉碎机；Waters2695型高效液相色谱仪；AL 204型分析天平；CPA225D型1/10万分析天平；1013AB型电热鼓风干燥箱；KQ500DE型数控超声波清洗器；DZKW4电子恒温水浴锅。

12试剂与试药

甲醇、乙腈、磷酸、甲酸均为色谱纯；中美纯水；自制蒸馏水。毛蕊花糖苷及梓醇对照品均购于成都曼斯特生物科技有限公司，批号分别为MUST13122711，MUST14122411；地黄苷A、地黄苷D、益母草苷对照品均购于四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为81720050，81720083，52949834。

13药材

试验在地黄道地产区河南温县武德镇亢村（35°3′31″N，113°7′17″E）怀药种植基地进行。种植材料（种栽）分别于2016年4月中下旬种植。选取至少10年未种植过地黄，地势平坦，土壤为沙壤土，肥力较好的地块。种栽选取直径2～4 cm的地黄块根，掰成长约15～2 cm的小段。起垄种植，垄宽40 cm，垄高15 cm，垄间距30 cm，双行种植。栽培管理同一般大田。于2016年7月10日、7月30日、8月20日、9月10日、9月30日、10月10日、10月20日、10月30日和11月10日分别取地黄植株的块根，每次随机选取10株长势一致的植株。

2方法与结果

21样品信息及处理方法

將新鲜地黄的块根洗净，除去泥沙，切成约5 mm的小块。从9月10号起，分地黄块根（KG）为菊花心（JHX）与非菊花心（FJHX）2部分；于55 ℃干燥后打粉过3号筛，粉末至干燥器中备用。样品信息见表1。

22指标性成分含量测定

221梓醇、毛蕊花糖苷含量测定

根据《中国药典》2015年版相关项进行[8]。对梓醇、毛蕊花糖苷含量测定进行了方法学考察，重复性试验、精密度试验、稳定性试验以及加样回收率试验，结果各项考察均符合含量测定要求，梓醇与毛蕊花糖苷对照品及供试品HPLC图见图1。

222地黄苷A、地黄苷D及益母草苷含量测定

2221色谱条件Dikma Diamonsil C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈水（4∶96）；流速1 mL·min-1；检测波长205 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。

2222混合对照品溶液的制备精密称取适量地黄苷A、地黄苷D、益母草苷对照品置于5 mL量瓶中，用流动相溶解并定容，用022 μm的微孔滤膜过滤，即得混合对照品溶液。

2223供试品溶液的制备取本品粉末05 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加60%甲醇50 mL，称重，超声提取40 min，放冷，再次称重，用60%甲醇补足失重，过滤，取续滤液20 mL，50 ℃水浴蒸干，用流动相定容至10 mL量瓶中，022 μm微孔滤膜滤过，即得。

2224线性关系考察精密吸取2222项对混合照品溶液02，04，08，12，10，12 mL，分别置于5 mL量瓶中，用流动相定容，制得6个不同质量浓度的对照品溶液。取上述对照品溶液，按2221项下色谱条件进样，测定峰面积，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，计算回归方程。结果见表2。

2225精密度考察精密吸取同一供试品溶液按2221项色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果地黄苷A、地黄苷D、益母草苷的峰面积RSD分别为 13%，11%，098%，表明仪器的精密度良好。

2226稳定性考察精密吸取同一供试品溶液按2221项色谱条件于4，8，12，16，20，24 h连续进样6次，记录峰面积，结果地黄苷A、地黄苷D、益母草苷的峰面积RSD分别为097%，12%，16%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2227重复性考察称同一样品6份，按2223项分别制得供试品溶液，再按2221项下色谱条件进样，记录峰面积，结果地黄苷A、地黄苷D、益母草苷的含量RSD分别为13%，15%，069%，说明该方法重复性良好。

2228加样回收率试验精密称定已知含量的样品9份，每份025 g，分别置于100 mL锥形瓶中，精密加入一定量的地黄苷A、地黄苷D、益母草苷对照品，按2223项方法制备供试品溶液，再按2221项色谱条件进样，记录峰面积并计算加样回收率，结果地黄苷A、地黄苷D、益母草苷平均加样回收率分别为1000%，9996%，9961%，RSD分别为16%，29%，24%。

2229样品的含量测定取各样品按2223项制备供试品溶液，按2221项色谱条件进样，对照品及供试品HPLC图见图2。

1地黄苷D； 2 地黄苷A； 3 益母草苷； A 对照品色谱图； B 供试品色谱图。

图2地黄苷A、地黄苷D、益母草苷对照品及供试品HPLC图

Fig2The chromatogram of reference substance and sample for rehmaionoside A，rehmaionoside D and leonuride

223指标性成分含量测定结果及分析

生育期内地黄菊花心与非菊花心中成分含量的变化与块根中趋势相符，且各成分在地黄菊花心与非菊花心部位分布并不均匀。益母草苷的含量在生育期内菊花心部位均明显高于非菊花心部位，差异达两倍之多；梓醇、地黄苷D、地黄苷A的含量非菊花心部位明显高于菊花心部位，但菊花心中地黄苷A的含量从10月下旬开始急剧上升；毛蕊花糖苷含量在菊花心与非菊花心中分布情况波动较大，前期非菊花心部位毛蕊花糖苷含量高于菊花心部位，但地黄采收期前后，菊花心中毛蕊花糖苷含量急剧升高，见表3，图3～7。endprint

23HPLC指纹图谱的建立与分析

231供试品溶液的制备

取样品粉末约08 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，称重，静置过夜，超声处理30 min，放冷，再称重，用甲醇补足失重。摇匀，过滤，取20 mL续滤液置蒸发皿中65 ℃蒸干，20%甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，022 μm微孔滤膜过滤，即得。

232对照品溶液的制备

分别精密称取适量梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷对照品置5 mL量瓶中，用20%甲醇溶解并定容，即得各对照品溶液。

233色谱条件

Athena C18色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；检测波长205 nm；流速10 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL；流动相为乙腈（A）001%醋酸水溶液（B）梯度洗脱（0～5 min，3%A；5～20 min，3%～5%A；20～75 min，5%～22%A；75～90 min，22%～28%A）。

234方法学考察

2341精密度试验精密吸取同一供试品溶液（S8）20 μL，连续进样5次，计算各个共有峰的相对保留时间、相对峰面积以及RSD，结果显示相对保留时间 RSD<30%，相对峰面积 RSD<50%，说明该仪器精密度良好。

2342重复性试验取同一批（S8）样品5份，按照232项方法制备供试品溶液，连续进样，计算各个共有峰相的对保留时间、相对峰面积以及RSD，结果显示，相对保留时间 RSD<30%，相对峰面积 RSD<50%，说明该方法重复性良好。

2343稳定性试验精密吸取同一供試品溶液（S8）20 μL，分别在 0，4，8，12，24 h进行测定，计算各个共有峰的相对保留时间、相对峰面积以及RSD，结果显示，相对保留时间 RSD<30%，相对峰面积 RSD<50%，说明样品在24 h内稳定性良好。

235HPLC指纹图谱的建立

将222项配制的对照品溶液按233项色谱条件分别进样，确定对照品的位置；将21批样品供试品溶液按233项色谱条件分别进样，记录色谱图，各对照品以及样品的指纹图谱叠加图见图8。

236对照图谱的生成

采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004 A版）对21批样品

A对照品色谱图； B 样品色谱叠加图； a 梓醇； b 地黄苷D； c 地黄苷A； d 益母草苷； e毛蕊花糖苷。

图8对照品色谱图及21批样品叠加色谱

Fig8The chromatogram of reference substance and superposition chromatogram for 21 batches of samples

HPLC图进行图谱拟合，设定时间窗宽度为03，选择S1为参照图谱，采用中位数法生成对照图谱，共标定20个共有峰，见图9。

237地黄样品的主成分分析

以21批样品的20个共有峰峰面积及保留时间为信息量，采用SPSS 190统计软件对其进行主成分分析，得到主成分的特征值和方差贡献率见表4，碎石图见图10，以特征值1为提取标准，得到前5个成分方差贡献率综合达到83363%，它们代表了这21批样品指纹图谱中大部分信息内容，同时结合碎石图可见主成分分析中特征值的变化情况，说明前5个主成分的分析结果基本显示出了不同批次样品之间的相似度和差异性。第1主成分主要反映了色谱峰12、11、13、益母草苷、16、10的信息，第2主

成分主要反映了色谱峰毛蕊花糖苷、10、18、梓醇的信息，第3主成分主要反映了色谱峰19，2，4的信息，第4主成分主要反映了色谱峰1、地黄苷A的信息，第5主成分主要反映了地黄苷D的信息，见表5。

238地黄样品的聚类分析

以21批地黄样品5个主成分所表达色谱峰峰面积及保留时间为原始数据，SPSS 190软件对样

品进行系统聚类分析，以欧式距离平方和作为样本的测度，相似性矩阵为统计量方法，最近邻元素、平方Euclidean及Z得分为分类标准，聚类结果见图11。

由图11知，当欧氏距离平方和为10时，样品被分为5类，其中样品s1和s2被单独分为2类，样品s3和s16被分为一类，样品s17～s21被归为一类，样品s4～s15被归为一类。s1，s2，s3样品为7月份到8月初的地黄块根样品，这一时期地黄的生长中心在地上部分，但地下部分块根处于膨大初期到快

速膨大期的过渡时期，气温的不断升高，使地黄块根各种代谢活动开始慢慢启动，所产生的次生代谢产物也随着生育期的进程而不断的发生变化，致使3个时期的地黄块根样品差别较大而被明显区分开来；样品s16为910地黄菊花心样品，此时期地黄块根进入明显膨大期，但菊花心处于膨大初期，所占比例较小，次生代谢活动并不活跃。从聚类分析结果可以看出，地黄菊花心部位与整体块根、非菊花心部位被分为了两大类，这与前期指标性成分在不同部位分布及富集结果有一定的契合度与相关性。

3讨论

怀地黄为我国大宗药材的道地品种，其个大、质量优，大多数中医药著作都把怀庆地黄作专条列出，《中药大辞典》更将怀地黄作为地黄的变种予以强调[9]。文献记载将“菊花心的存在与否”做为判断地黄质量优劣及道地性的一个形态特征。为了进一步分析其内在特征，本研究对地黄“北京1号”品种菊花心、非菊花心及块根部位中毛蕊花糖苷、梓醇、地黄苷A、地黄苷D及益母草苷的含量进行分析，发现不同成分在菊花心与非菊花心部位富集量有差异并具有一定的规律性，同时通过聚类分析，怀地黄块根中菊花心部位与非菊花心部位、整体块根被分为两类，以上都说明了怀地黄菊花心与非菊花心部位化学质量特征存在明显差异。菊花心为地黄块根的木质部，非菊花心则为其周皮与次生韧皮部，木质部主要负责输送水分，韧皮部主要负责输送养分（有机物）等，因此，正常情况下非菊花心中次生代谢产物的量一般要高于菊花心，但实验结果表明，梓醇、毛蕊花糖苷与地黄苷D在菊花心与非菊花心部位的分布相对均匀，地黄苷A的含量非菊花心部位明显高于菊花心部位，而益母草苷的含量则菊花心部位明显高于非菊花心部位，这一发现不仅可以为地黄有效成分组织化学的定位提供参考，而且也提出了新的问题，地黄次生代谢产物在块根不同组织的富集与地黄块根的发育及质量特征的形成有何联系？地黄中各有效成分在不同品种地黄菊花心与非菊花心部位的含量高低及相对比例是否具有相同的规律？菊花心的特征和质量与地黄的道地性之间存在什么样的关系？这些问题都有待于后期进一步研究。endprint

地黄的主要成分有多种苷类、多糖类、氨基酸及少量的β谷甾醇等，以苷类为主，在苷类中又以环烯醚萜苷为主，其中主要是梓醇、地黄苷A、地黄苷D、益母草苷、桃叶珊瑚苷等。环烯醚萜苷类是地黄发挥药理作用的主要物质基础，具有广泛的生物活性。文献研究表明地黄苷A，D等环烯醚萜苷类，具有较好的免疫活性，对骨髓造血及外周血细胞细胞增殖具有促进作用，增强免疫功能等药理作用，且热稳定性强，在炮制加工过程中几乎不被分解[1011] 。地黄中梓醇含量最高，益母草苷、地黄苷A、地黄苷D是仅次于梓醇含量的环烯醚萜苷类成分，王慧森等[12]曾在大鼠含药血清中发现梓醇、地黄苷D与益母草苷均以原型入血。但2015年版《中国药典》中仅将“梓醇”这一种环烯醚萜苷类成分作为评价地黄质量是否合格的指标之一，地黄中其他环烯醚萜苷类成分对地黄的临床疗效有没有影响？仅仅用梓醇这一指标是否可以完全反映地黄质量的优劣呢？本实验发现益母草苷含量在菊花心部位富集量远高于非菊花心部位，益母草苷含量的高低与地黄的质量是否有一定的相关性？前人将菊花心的存在与否作为判断道地地黄的特征是否与菊花心中益母草苷的含量高有一定的关系呢？

中药药效是在多种有效成分相互协同作用下产生的，有效成分的种类、含量及相对比例都会影响其药效的发挥。单纯的指标性成分含量分析并不能反映中药的质量整体特征，而HPLC指纹图谱能够清晰地反映出样品中所含化学成分的种类和相对含量的高低，可以较为全面的表征样品整体的化学质量特征，目前已广泛应用于中药的整体化学质量控制。本研究建立了菊花心、非菊花心、整体块根的HPLC指纹图谱，并采用主成分分析和聚类分析对其进行了分析，结果发现，地黄中的梓醇、益母草苷、地黄苷A、地黄苷D 4种环烯醚萜苷类成分和毛蕊花糖苷均作為主成分参与了地黄的质量分析，说明他们与地黄的质量具有一定的相关性。另外，还有其他未知的成分同样作为主成分来表征了地黄的整体化学质量信息，而且，聚类分析结果表明菊花心部位的化学质量特征不同于非菊花心和块根，那么这种差异的存在来源于哪些化学成分，这些化学成分与地黄的质量之间存在什么样的关系？后期可利用液相色谱质谱联用技术对这些未知成分进行鉴定，同时结合相关药理药效实验进行谱效关系研究，确定其质量控制的关键成分，进一步探索怀地黄菊花心部位存在的重要性与意义所在，完善地黄的质量控制标准，为怀地黄质量评价、种质资源开发以及道地性的揭示提供科学参考。

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