不同品种根类中药饮片耐胆盐革兰阴性菌污染研究
2017-11-17邓彦王娅珂韩晓宇王雅琪江珍玉于志君邓海英
邓彦 王娅珂 韩晓宇 王雅琪 江珍玉 于志君 邓海英
[摘要]该研究通过对8种根类饮片共计40份样本需氧菌总数计数（total aerobic microbial count， TAMC）、酵母、真菌总数计数（total yeast and mould count，TYMC），探讨不同作用类型根类中药饮片微生物污染状况；进一步评价样品耐胆盐革兰阴性菌污染载量，并运用革兰阴性杆菌生化鉴定系统对分离到的耐胆盐革兰阴性杆菌进行鉴定。结果显示，85%（34/40）的样品TAMC超过1 000 CFU·g-1，30%（12/40）的样品TYMC超过100 CFU·g-1；45%（18/40）的样品检出耐胆盐革兰阴性菌污染，7批样品检测结果N>1 000 MPN·g-1，从13批样品中分离出阴沟肠杆菌、河生肠杆菌、创伤埃希氏菌、坂崎肠杆菌等16株耐胆盐革兰阴性杆菌，其中阴沟肠杆菌是丹参样品中分离到的优势菌；河生肠杆菌是麦冬样品中分离到的优势菌；假结核耶尔森菌是党参样品中分离到的优势菌。上述研究结果表明，武汉市场中根类饮片存在较严重的微生物污染，微生物种类对药材成分具有一定的选择特异性，依据不同作用类型饮片所含化学成分有针对性地鉴定控制菌类型、制定控制菌检验限度，对提高中药饮片的安全使用具有重要意义。
[关键词]根类饮片； 微生物限度； 耐胆盐革兰阴性菌； 控制菌
[Abstract]To investigate the microbial contamination in Chinese herbal decoction pieces with different functional types by studying the total aerobic microbial count （TAMC）， and total yeast and mould count （TYMC） in 40 samples of 8 types of root decoction pieces； further evaluate the contamination load of bileresistant Gramnegative bacteria， and identify the Gramnegative bacteria by using biochemical identification system for Gramnegative bacteria Our results showed that the TAMC value was more than 1 000 CFU·g-1 in 85% （34/40） samples， and was more than 100 CFU·g-1 in 30% （12/40） samples； the contamination of bileresistant Gramnegative bacteria was detected in 45% （18/40） of the samples The bileresistant Gramnegative bacteria load of seven batches of samples was N>1 000 MPN·g-1 Sixteen bacterium strains including Serratia plymouthensis， Cedecea neteri， Escherichia vulneris， Klebsiella oxytoca， Enterobacter amnigenus， E cloacae， E sakazakii， Proteus penneri and E gergoviae were obtained and identified E cloacae was the predominant bacterium that was isolated from Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma， while E amnigenus， Yersinia pseudotuberculosis was the typical bacterium of Ophiopogonis Radix and Codonopsis Radix， respectively All these suggested that the contamination of bileresistant Gramnegative bacteria was severe for the root decoction pieces in Wuhan city Microbial species have certain selection specificity for medicinal ingredients， so the type and limit of control bacteria for detection should be formulated according to the pollution type and quantity of bileresistant Gramnegative bacteria.
[Key words]decoction pieces； microbe load； bileresistant Gramnegative bacterium； control bacterium
中藥饮片是一种特殊的药品类型，既可以用于直接服用，又可作为制剂和配方的原料，其中根类饮片是中药饮片的主要来源之一。由于根类药材多来源于土壤，长期接触多种有害元素及微生物，其安全性是近年来关注的重点[12]，中药饮片的微生物控制已被列入《中国药典》2015年版[3]。耐胆盐革兰阴性菌是一类不发酵乳糖、可利用葡萄糖且可耐受胆盐的革兰阴性菌，包括沙门菌、志贺菌等肠道致病菌及粘质沙雷氏菌等条件致病菌，在特定条件下可引起人类消化系统感染。文献报道，我国中药饮片耐胆盐革兰阴性菌总体污染情况严重[45]，周爽等[6]对17个品种174批饮片中耐胆盐革兰阴性菌污染状况进行研究，结果显示污染率达810%。《中国药典》2015年版已将耐胆盐革兰阴性菌规定为非无菌产品检验控制菌[3]，但因缺乏系统性累积数据，尚未对中药饮片耐胆盐革兰阴性菌检验结果进行详细规定。欧美等国家药典亦均规定植物性来源药物的耐胆盐革兰阴性菌控制[7]。目前，关于中药饮片耐胆盐革兰阴性菌污染多限于部分品种的定性和半定量研究[89]，对不同类型饮片的微生物污染特点少有报道。相同作用类型的中药饮片多具有相类似的物质成分，在药材生长过程和贮存期常对不同微生物种类具有选择特异性。本研究以8种常见中药饮片为代表，考察了不同品种根类中药饮片的微生物污染状况，对样品中污染的耐胆盐革兰阴性菌进行定性定量检测，分析比较不同作用类型根类中药饮片耐胆盐革兰阴性杆菌污染特点，并对污染原因进行了探讨，为针对性地制定根类饮片的控制菌检验类型及限度提供依据。endprint
1材料
11仪器双人单面净化工作台（SWCJ2FD，苏州净化）；生化培养箱（DHP90，上海索普仪器有限公司）；生物安全柜（美国Thermo公司）；立式压力蒸气灭菌器（LDZH150KBS，上海申安医疗器械厂）；医用冷藏箱（HYC940，青岛海尔）。
12药材信息与分类分别以白术、党参等8味中药饮片为代表进行试验，所有样品均购于武汉市不同辖区零售药店及医院，由湖北省药品监督检验研究院康四和主任药师鉴定，并在0～8 ℃条件下保存于武汉科技大学医学院微生物学实验室。根据药用功能，将各味饮片分别分为燥湿、补益、活血、润肺等类别（当归虽有活血作用，但其含有糖类、氨基酸等成分，具有补血功能，本研究将其归入补益组进行统计）。信息见表1。
13菌株金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus [CMCC （B） 26 003]；大肠埃希菌Escherichia coli [CMCC （B） 44 102]；铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa [CMCC （B） 10 104]；枯草芽胞杆菌Bacilllus subtilis [CMCC （B） 63 501]；白色念珠菌Candida aibicans[CMCC （F） 98 001]；黑曲霉Aspergillus niger[CMCC （F） 98 003]（均由湖北省药品监督检验研究院提供）。
14培养基及试剂胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、胰酪大豆胨液体培养基、pH 70氯化钠蛋白胨缓冲液体培养基、肠道增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、普通琼脂平板、葡萄糖发酵培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、氨基酸对照培养基、葡磷胨水液体培养基均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，培养基适用性检查均符合《中国药典》2015年版和《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》规定。革兰染液、班氏试剂、甲基红试剂及靛基质试剂等购于杭州微生物试剂有限公司。J2003发酵细菌生化鉴定管、J2002肠杆菌科细菌生化编码鉴定管由杭州微生物有限公司提供。
2方法
21需氧菌总数及酵母、真菌总数计数依据《中国药典》2015年版[2]规定，取样品25 g，加入225 mL pH 70无菌氯化钠缓冲蛋白胨稀释液匀浆制备1∶10样品匀液，并进行方法适用性实验。将上述1∶10样品匀液梯度稀释为4个稀释度1∶100，1∶1 000，1∶1万，1∶10万，分别取100 μL接种至胰酪大豆胨琼脂平板，每个稀释度涂布2个平板，30～35 ℃培养3～5 d后进行需氧菌总数计数（total aerobic microbial count，TAMC）；同法取各样品稀释液100 μL接种至含001%氯霉素的沙氏葡萄糖琼脂平板，20～25 ℃培养5～7 d后进行酵母及真菌总数计数（total yeast and mould count，TYMC）。
22耐胆盐革兰阴性菌定性定量检测取10 g样品于无菌匀浆杯中，加入100 mL无菌胰酪大豆胨液体培养基，1 500 r·min-1匀浆1 min，制成1∶10供试品溶液，20～25 ℃培养2 h。将预培养物用无菌胰酪大豆胨液体培养基梯度稀释成 1∶100，1∶1 000，1∶1万，1∶10万的稀释液，分别取1 mL不同稀释度预培养物稀释液，接种于10 mL无菌肠道增菌液体
培养基中，30～35 ℃培养 24～48 h。再取上述肠道增菌培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35 ℃培养18～24 h。有菌落生长者，则对应管判为阳性，无生长则为阴性。根据各培养管培养结果，查MPN值表知1 g供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌的最可能数（N）[3]。
23耐胆盐革兰阴性杆菌分离与鉴定根据22项培养结果，从细菌生长明显的紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上挑取一接种环菌，在普通琼脂平板上做分区划线，30～35 ℃培养18～24 h。挑取不同可疑单菌落，革兰染色，显微镜下观察形态，选取革兰阴性杆菌，进行分离纯化。依据产品说明书，运用相应革兰阴性细菌生化鉴定管对纯化细菌进行生化反应，通过编码查得鉴定结果。
24统计学处理本实验测定结果运用IBM SPSS Statistics进行处理，P<005显示有统计学意义；运用Graphpad Prism 50软件作图。
3结果
31需氧菌总数、酵母及真菌总数计数结果分别采用平板涂布法对样品需氧菌总数、酵母及真菌总数进行计数。凡样品1∶10稀释组在胰酪大豆胨琼脂平板上或沙氏葡萄糖琼脂培养基上未见菌落生长者，计其对数值为05。需氧菌总数计数结果显示，40批样品中共有3批样TAMC<10 CFU·g-1，3批样品TAMC为10～1 000 CFU·g-1，34批样品TAMC>1 000 CFU·g-1。根据对样品不同作用類别统计，lgTAMC均值最高组为活血组，达453，其次为润肺组400，补益组377，燥湿组298，各组间无统计学差异（P=0650），见图1。酵母及真菌总数计数结果显示，12批样品TYMC<10 CFU·g-1，14批样品TYMC为10～100 CFU·g-1，12批样品TYMC>100 CFU·g-1；不同作用类别中，活血组lgTYMC均值为206，润肺组176，补益组152，燥湿组140，各组间未显示统计学差异，见图1。
A需氧菌总数（TAMC）；B酵母、真菌总数（TYMC）。
32耐胆盐革兰阴性菌定性定量检验结果样品耐胆盐革兰阴性菌定量总体检测结果显示，8个品种40批样品中，22批样品在紫红胆盐平板上未见细菌生长，18批样品检出耐胆盐革兰阴性菌，占总样本量45%（18/40）。其中，当归5批，党参4批，天冬和丹参各3批，麦冬2批，川芎1批。半定量检测结果显示，N>1 000 MPN·g-1的样品有7批，分别为党参2批，天冬2批，当归、麦冬、丹参各1批。检出样品主要集中于补益组和润肺组，见表2。endprint
33不同品种及生产地域样品耐胆盐革兰阴性菌检验结果根据本实验半定量检验结果，分别对不同检出量进行赋值，N<10赋值05，10
34耐胆盐革兰阴性杆菌鉴定结果本研究从13批根类饮片中分离鉴定出耐胆盐革兰阴性杆菌16株，菌株鉴定结果见表3。其中活血组分离到阴沟肠杆菌2株，普里毛斯沙雷氏菌、奈特氏西地西菌及产酸克雷伯菌各1株；润肺组分离到河生肠杆菌2株，阴沟肠杆菌、坂崎肠杆菌及格高菲肠杆菌各1株；补益组分离到假结核耶尔森氏菌2株、创伤埃希氏菌、普里毛斯沙雷氏菌、潘尼变形杆菌及泰勒奇肠
A 8种饮片耐胆盐革兰阴性菌检测；B 不同地区生产饮片耐胆盐革兰阴性菌检测。
图2不同根类药材耐胆盐革兰阴性菌定量检测结果分布
Fig2The results of bileresistant Gramnegative bacteria analyzed based on sample kind and distribution
杆菌各1株。所分离的阴沟肠杆菌、河生肠杆菌、假结核耶尔森氏菌3种菌的鉴定结果见表4。
4讨论
根类药材是中药材的主要来源之一，由于生长于土壤中，其所携带背景微生物复杂，并在种植过程中受施肥等因素影响易造成外来微生物的污染。我国饮片企业生产条件差异大，生产过程质量控制水平不一致，致使部分企业根类饮片极易残存药材本底微生物。同时在饮片贮藏过程中保管不严格，也会造成新的微生物污染。中药饮片因其药物特殊性，其微生物控制，尤其是致病菌的控制已成为药物安全性控制的主要内容之一。本研究选用8种常见的根类药材饮片作为研究对象，根据其作用类型分为燥湿、补益、活血、润肺组等几个类别，对40批样品微生物污染现状及原因进行探讨。通过需氧菌总数、酵母及真菌总数计数，85%（34/40）的样品TAMC超过1 000 CFU·g-1，30%（12/40）的样品TYMC超过100 CFU·g-1，表明所检测根类饮片微生物污染情况较为严重。各类别间lgTAMC均值虽无统计学差异，但活血组、润肺组中同组不同样品间差异较小，表明该类样品较其他样品具有更高细菌污染水平。补益组与润燥组中不同样品间差异较大，
表4耐胆盐革兰阴性杆菌鉴定代表性
Table 4The representative results of of bacterial strains identified in the samples
菌株阴沟肠杆菌河生肠杆菌假结核耶尔森菌
硫化氢---
苯丙氨酸---
葡萄酸盐++-
蛋白胨水---
枸橼酸盐++-
尿素--+
赖氨酸---
鸟氨酸+--
棉子糖++-
山梨醇++-
侧金盏花醇---
木糖+++
氨基酸对照---
動力++-
甲基红--+
葡萄糖产气+++
提示该类样品微生物污染程度差异可能与生产、储藏等环节有关。
耐胆盐革兰阴性菌为一大类条件致病菌，广泛存在于人与动物肠道及自然界中，在特定条件下可引起人类消化系统感染。本研究对所收集的40批样品中耐胆盐革兰阴性菌进行了检测，结果有45%（18/40）的样本检出耐胆盐革兰阴性菌，检出阳性率低于文献报道结果[46]，主要是由于选用的药材品种、样品数量及不同生产单位微生物控制水平不同所致。研究中选用了净制、切制等饮片样品，排除了炮制加工方法的影响，提示药材种植及品种所含成分等因素可能是造成耐胆盐革兰阴性菌污染程度差异的重要原因。目前大量药材品种均实现人工种植，耐胆盐革兰阴性菌主要来源于人与动物消化道，在动物排泄物中具有较高含量，种植过程中施肥等因素易造成耐胆盐革兰阴性菌污染。同时微生物在生长过程中受药材成分影响，不同种类的微生物对药材成分具有一定的选择特异性，而相同功能作用的药材往往具有相近的成分类型。本研究图2A结果显示，党参、当归、天冬等补益、润肺类样品lgTAMC均值高，且耐胆盐革兰阴性菌污染载量较高，提示样品需氧菌污染主要来源于耐胆盐革兰阴性菌污染，这可能与样品中所含多糖类成分可促进该类污染菌的生长有关；白术样品lgTAMC均值高，但全部样品则均未检出耐胆盐革兰阴性菌，提示白术样品中的需氧菌污染主要来源于其他类型的细菌。因此，中药饮片检测标准可依据药材成分不同，如多糖类成分，分别拟定不同的耐胆盐革兰阴性菌限度值；对于含有多糖等成分的饮片在生产、储藏等环节应提出更严格的微生物控制措施。
本研究40批样品的生产地分别来源于7个省区，通过对其生产地进行分析，显示8种饮片样品主要来源于湖北、安徽等地区，其耐胆盐革兰阴性菌检出率分别为412%，462%，具有较高的检出率。研究中部分药材尽管产地一致，但不同饮片生产单位的样品污染程度存在差异，如当归均来源于甘肃，其饮片微生物检测结果差别较大，这可能是由于不同企业生产管理水平不一致造成的，提示提高生产管理水平可有效降低微生物污染风险。
本文对分离的不同单菌落进行革兰染色，經显微镜下检视，结果以革兰阴性杆菌为主，仅见极少数革兰阴性球菌。基于革兰阴性杆菌在消化道感染疾病中的重要意义，本研究对分离的耐胆盐革兰阴性杆菌进行了进一步鉴定，结果13批样品中共分离出革兰阴性杆菌16株，其中从丹参（Sal1，Sal4）中分离出阴沟肠杆菌2株，从麦冬（Oph3，Oph4）中分离到河生肠杆菌2株、从党参（Cod1，Cod5）中分离到假结核耶尔森氏菌2株、从党参（Cod3）中分离到普里毛斯沙雷氏菌1株，并从川芎（Chu5）、麦冬（Oph4）、党参（Cod4）3个样品均同时分离到2种不同细菌。提示同一品种饮片往往携带有相似类型的一种或多种细菌，其结果与文献报道一致[12]，也证实了不同类型细菌对药材成分具有选择特异性。本研究分离菌株均属肠杆菌科细菌，多数为条件致病菌，这类细菌过去在食品药品检验中未引起足够重视。但近年来，随着对阴沟肠杆菌临床分布及耐药性研究的深入，临床样本中阴沟肠杆菌的分离率越来越高，且由于广谱抗生素的滥用，导致由多重耐药阴沟肠杆菌引起的医院内感染越来越常见[1314]，提示在饮片的控制菌类型研究工作中，对于样品中分离到的优势细菌，需进一步进行致病性及耐药性研究。本研究还在麦冬Oph4样品中分离到一株阪崎肠杆菌，该菌是婴幼儿奶粉中的检验控制菌[15]，属于A类致病菌，值得重视。
本研究在对8种根类饮片进行微生物污染总体评价的基础上，进一步对耐胆盐革兰阴性菌进行了定性定量检测，对其中的耐胆盐革兰阴性杆菌进行了分离鉴定，并对不同种类和作用类型饮片微生物污染特点进行探讨，为中药饮片中耐胆盐革兰阴性菌检验限度及特定控制菌类型标准制定奠定了基础。
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[责任编辑孔晶晶]endprint
