黄连提取物的中药生物药剂学分类系统研究

刘洋+尹秀文+王子禹+李雪莲+潘孟+李彦萍+董玲

[摘要]中药生物药剂学分类系统（CMMBCS）的优势之一，是将分类归属的研究层面从单成分扩展到中药多成分，进而从多成分扩展到中药整体研究层面。该研究以黄连提取物中的生物碱为主要研究对象，探究生物碱单一成分及黄连提取物中各生物碱成分的水溶解性及肠渗透性变化规律，并对黄连提取物整体做中药生物药剂学分类系统归属研究。其中采用经典摇瓶法和高效液相色谱法测定生物碱单一成分及提取物中各生物碱成分的溶解度变化及分类，采用在体单向肠灌流法进行生物碱吸收定量研究，同时采用自定义权重系数法对黄连提取物整体进行渗透系数计算。

[关键词]黄连提取物； 生物碱； 溶解性； 肠渗透性； 中药生物药剂学分类系统

[Abstract]One of the advantages of biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica （CMMBCS） is expanding the classification research level from single ingredient to multicomponents of Chinese herb， and from multicomponents research to holistic research of the Chinese materia medica In present paper， the alkaloids of extract of huanglian were chosen as the main research object to explore their change rules in solubility and intestinal permeability of singlecomponent and multicomponents， and to determine the biopharmaceutical classification of extract of Huanglian from holistic level The typical shakeflask method and HPLC were used to detect the solubility of single ingredient of alkaloids from extract of huanglian The quantitative research of alkaloids in intestinal absorption was measured in singlepass intestinal perfusion experiment while permeability coefficient of extract of huanglian was calculated by selfdefined weight coefficient method.

[Key words]extract of huanglian； alkaloids； solubility； intestinal permeability； biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica

生物藥剂学分类系统自被提出以来[1]，历经20余年的数据积累和科学研究，已成为化学药物基础研究和研发中十分重要的工具之一[2]。其依据水溶解性及肠渗透性高低对药物进行分类，核心要素溶解度、溶出度和渗透性又分别代表了影响药物被吸收的程度、药物从制剂中释放的速度和药物穿透肠细胞的转运速度及药物吸收浓度的依存性[34]。为了贯彻这种以吸收为精髓的分类理念，并充分结合中药多成分复杂体系及中药临床疗效实际的特点，课题组在2014年提出了“中药生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）”的学术理念[5]。CMMBCS的研究以吸收与否为界，先在复杂多成分环境下定性锁定可吸收成分，再定量测定可吸收成分的水溶解性和肠渗透性数据从而进行科学归类，为揭示中药多成分吸收的相互影响及相关机制的基本研究奠定基础。基于理论背景及“多成分层次差异比较法”的指导，CMMBCS探讨中药代表性目标成分、多成分环境下目标成分、复方整体3个层次之间的内部规律，从而建立CMMBCS预测模型。

课题组以经典方 “葛根芩连方”为研究载体，前期已对高含量成分葛根素的BCS属性[6]及多成分环境对其溶解度及渗透性的影响做了分析[78]，对小檗碱单一成分、小檗碱在黄连药材中[9]、小檗碱在葛根芩连复方中[10]的CMMBCS属性做了系列研究，同时通过离体法及在体法，初步锁定了黄连水提液中可透过肠壁吸收并吸收入血的目标成分[11]。本研究在前期研究的基础上，以黄连提取物为研究对象，对中药提取物CMMBCS属性进行探索与测定，并对与其相关的数学公式进行了应用与验证，以期为中药整体乃至中药复方的CMMBCS归属研究提供数据与理论支持。

1材料

11仪器

LC20AT高效液相色谱仪（SPD20A型紫外检测器，SIL20A自动进样器，日本岛津公司）；BT25S电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；DZKW4电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；981B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；KH7200DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；STARTER2100实验室pH计（奥豪斯仪器上海有限公司）；注射泵（LSP021B，保定兰格恒流泵有限公司）；高速冷冻离心机（SIGMA，德国）。

12试剂与药品endprint

盐酸小檗碱对照品（批号110713201212，中国食品药品检定研究院，纯度868%）；木兰花碱对照品（批号M2903S1，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；非洲防己碱对照品（批号Y13M6W1，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；表小檗堿对照品（批号H25F3X1，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；盐酸药根碱对照品（批号Z15T4B1，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；盐酸黄连碱对照品（批号ZS0924BE14，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；盐酸巴马汀对照品（批号KS0922CF14，上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；盐酸小檗碱原料（批号130808，陕西中鑫生物技术有限公司）；乙腈（色谱级，美国Fisher公司）；纯净水（娃哈哈集团公司）；黄连提取物（实验室自制）；其他试剂均为分析纯。

13实验动物

SD大鼠，雄性，体质量200～250 g，斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，许可证号 SCXK（京）20160002。

2方法

21溶液的制备

211对照品溶液的制备

分别精密称定木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量置于量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀后得质量浓度分别0203，0203，0100 4，0243，0102 4，0264，0400 g·L-1的各对照品储备液。精密移取木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品溶液适量置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀备用，得混合对照品母液。

212不同pH缓冲液的制备

pH 10盐酸溶液：量取盐酸溶液9 mL，加水稀释至1 000 mL，即得；pH 40缓冲液：取一水枸橼酸1290 g，取磷酸氢二钠2725 g，加水1 000 mL溶解，即得；pH 68缓冲液：取磷酸二氢钾170 g和磷酸氢二钾178 g，加水溶解稀释至1 000 mL，即得；pH 74缓冲液：取磷酸二氢钾681 g，加01 mol·L-1氢氧化钠溶液395 mL稀释至1 000 mL，即得。KrebsRinger′s营养液（KR液）：称取NaCl 780 g，KCl 035 g，CaCl2 037 g，NaHCO3 137 g，NaH2PO4 032 g，MgCl2 002 g，葡萄糖140 g；加蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH到739～741，放置备用。

213黄连提取物的制备

课题组前期通过单因素与正交试验方法，确定黄连提取物的最佳制备方法。取黄连粉末25 g，以10倍量的80%乙醇加热回流提取2次，每次1 h，得黄连总生物碱粗提物。选用AB8型大孔树脂，以径高比1∶7、上样浓度005 g·mL-1（生药浓度）、上样体积45 倍柱体积、吸附流速10 mL·min-1、水洗体积1倍柱体积、50%乙醇洗脱、洗脱剂用量4倍柱体积的工艺参数对粗提物进行纯化，富集黄连中的生物碱总量合计可达4895%。

22方法学考察

221生物碱单一成分生物样品的分析方法学考察

2211色谱条件Waters Atlantis T3色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相①木兰花碱及非洲防己碱：水溶液（03%磷酸05%三乙胺，调pH 30）乙腈（80∶20）；②表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀及盐酸小檗碱：水（03%磷酸05%三乙胺，调pH 30）乙腈（70∶30）；流速10 mL·min-1；检测波长265 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2212标准曲线的绘制分别精密移取211项下7种生物碱对照品储备液一定体积于5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成一系列浓度的生物碱对照品溶液。分别精密吸取上述各对照品溶液10 μL进样，测定其峰面积。分别以木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱各对照品溶液的质量浓度（mg·L-1）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归。

2213精密度试验取各对照品溶液，按上述色谱条件分别重复进样6次，记录峰面积，分别计算相对标准偏差（RSD）。

2214重复性试验精密称取各对照品制备其溶液各6份，分别精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积，分别计算RSD。

2215稳定性试验取各生物碱生物样品溶液分别于0，2，4，6，12，24 h进样检测，记录峰面积，分别计算RSD。

2216回收率试验取空白肠灌流液，分别加入不同量各对照品。高效液相测其含量，计算回收率及其RSD。

222黄连提取物生物样品的分析方法学考察

2221色谱条件Waters Atlantis T3色谱柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）水（B，含03%磷酸，05%三乙胺，调pH 30），梯度洗脱（0～2 min，13%A；2～4 min，13%～20%A；4～50 min，20%～25%A；50～55 min，25%～30%A；55～63 min，30%～70%A；63～65 min，70%～95%A；65～70 min，95%～13%A；70～80 min，13%A）；检测波长265 nm；流速06 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL。

2222标准曲线的绘制精密移取混合对照品母液010，050，100，200 mL分别置于5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用，与混合对照品母液共同配制成一系列浓度的混合对照品溶液。过022 μm微孔滤膜，精密取上述溶液10 μL注入高效液相色谱仪，记录峰面积。分别以木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱各对照品溶液的浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线并进行回归。endprint

2223精密度试验取混合对照品溶液，按色谱条件分别重复进样6次，测定峰面积。

2224重复性试验取黄连提取物粉末5份，平行制备5份供试品溶液，按色谱条件测定峰面积。

2225稳定性试验精密吸取新配制的供试品溶液，分别在0，2，6，12，24 h按色谱条件测定峰面积。

2226加样回收率试验精密称取黄连提取物粉末700 mg，分别加入精密称定的7种生物碱对照品，平行操作5份，按色谱条件测定峰面积。

23溶解度测定

231生物碱单一成分平衡溶解度测定

取待测生物碱单一成分适量，置2 mL离心管中，准确加入pH 74缓冲液10 mL，（37±1）℃水浴加热，同时每隔5 min强力振摇30 s，观察30 min，至待测化合物不再溶解，将溶液置于室温条件下静置一定时间后15 000 r·min-1离心15 min，分别加入pH 74缓冲液适当稀释后，再经过15 000 r·min-1离心15 min，取上清液过045 μm微孔滤膜，注入高效液相色谱仪测定其溶解度。

232黄连提取物中各生物碱成分平衡溶解度的测定

黄连提取物平衡溶解度的测定采用经典摇瓶法，测定其在不同pH介质（pH 10缓冲液、pH 40缓冲液、pH 68缓冲液、pH 74缓冲液及水）中的平衡溶解度。取黄连提取物适量，置10 mL具塞试管中，加入不同pH 缓冲液50 mL（准确加入量），（37±1）℃水浴加热，同时每隔5 min强力振摇30 s，观察30 min，至待测化合物不再溶解，将溶液置于室温条件下静置一定时间，分别取1 mL溶液置于离心管中，15 000 r·min-1离心15 min，加入相应的介质适当稀释后，再经过15 000 r·min-1离心15 min，取上清液过045 μm微孔滤膜，注入高效液相色谱仪测定其溶解度。

31方法学分析

结果表明，生物碱单一成分中，木兰花碱在199～1592 mg·L-1线性关系良好，R2=0999 8；非洲防己碱在199～1989 mg·L-1线性关系良好，R2=0999 9；表小檗碱在197～1771 mg·L-1线性关系良好，R2=0999 7；盐酸药根碱在095～1905 mg·L-1线性关系良好，R2=10；盐酸黄连碱在201～2408 mg·L-1線性关系良好，R2=0999 9；盐酸巴马汀在103～5174 mg·L-1线性关系良好，R2=10；盐酸小檗碱在694～10404 mg·L-1线性关系良好，R2=0999 8。木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀与盐酸小檗碱的精密度RSD分别为072%，060%，13%，030%，043%，043%及054%，重复性RSD分别为099%，11%，16%，18%，11%，11%及15%，稳定性RSD分别为038%，075%，060%，036%，039%，034%，048%。仪器精密度及方法重复性良好，样品在24 h内稳定，加样回收率9545% ～ 1004%，RSD均小于30%。

黄连提取物中的各个生物碱木兰花碱、非洲防己碱、表小檗碱、盐酸药根碱、盐酸黄连碱、盐酸巴马汀与盐酸小檗碱在025～1235，016～796，048～2389，015～747，060～2999，042～2117，139～6936 mg·L-1线性均良好，R2分别为0999 1，0999 5，0999 9，0999 6，0999 4，0999 4，0999 4，精密度RSD依次为028%，095%，17%，18%，054%，047%，027%，重复性RSD依次为14%，19%，20%，30%，17%，18%，15%，稳定性RSD依次为071%，11%，30%，27%，18%，10%，022%。仪器精密度及方法重复性良好，样品在24 h内稳定，加样回收率9613% ～ 1055%，RSD均小于30%。

32溶解度结果

321生物碱的平衡溶解度

由于后续灌流实验中所采用的KR液pH为74，因此选择 pH 74缓冲液作为各单一成分溶解度测定的pH 介质。而各生物碱单一成分在黄连提取物的环境中，溶解度因介质pH的不同而不同，结果见表1。单一成分溶解度与其在提取物这一多成分环境中的溶解度有所不同，结果见表2。

表

由结果分析可知，黄连提取物中各生物碱成分的溶解度在pH 10时最小，在水中溶解度最大。黄连提取物中各生物碱的溶解度均随pH的增大基本呈增大趋势，溶解度曲线趋势相似；各生物碱单一成分的平衡溶解度与其在黄连提取物中的平衡溶解度相比均有显著性差异，其中木兰花碱、盐酸药根碱及盐酸巴马汀在提取物中的溶解度显著减小，而非洲防己碱、表小檗碱、盐酸黄连碱及盐酸小檗碱的溶解度显著增大。尤其是盐酸小檗碱，其在黄连提取物中的平衡溶解度较其单一成分溶解度提升约15倍，可能与其本身溶解度较大且在提取物中含量最高有关（相对于提取物中的其他生物碱）。此结果与课题组前期研究结果[9]相一致，表明了黄连中其他成分有利于盐酸小檗碱溶解度的增加。

322黄连提取物的溶解度及剂量数D0

由321项结果可知，黄连提取物中各生物碱成分的溶解度在pH 10时最小。依据各生物碱测得的平衡溶解度及其在黄连提取物中的含量可推算黄连提取物浓度，根据公式（1）Cs的定义，以黄连提取物中各成分在pH 10缓冲液中的溶解度推算黄连提取物的溶解度，结果见表3。

由以上结果可知，各生物碱达到平衡溶解度时各自对应的黄连提取物的浓度/溶解度不同，则在各自对应的最大的黄连提取物浓度/溶解度状态下，即可保证各生物碱成分溶解完全。当黄连提取物质量浓度为15693 g·L-1时，黄连提取物中各生物碱成分均已达到饱和状态，故确定黄连提取物的最小溶解度为15693 g·L-1。endprint

药典中凡例项下二十七项规定“饮片的[用法与用量]，除另有规定外，用法系指水煎内服；用量系指成人一日常用剂量，必要时可根据需要酌情增减。”药典中黄连用量为2～5 g，外用适量。因此，取5 g为黄连的最大用药剂量，相当于自制黄连提取物的0787 g。因此，黄连提取物的剂量数D0经公式（1）计算，为0201。黄连提取物D0<1，属于高溶解度。

33渗透性结果

331生物碱的有效渗透系数

用KR试液配制黄连提取物溶液，考察质量浓度015 g·L-1（低浓度）、03 g·L-1（中浓度）和045 g·L-1（高浓度）的黄连提取物在体肠吸收情况，结果见表4。

为便于与黄连提取物中生物碱的渗透性进行比较，单一生物碱成分的研究仅选取大鼠空肠为灌流对象，中浓度肠灌流液为浓度参照。由于盐酸黄连碱和盐酸小檗碱在KR营养液中的溶解度问题，其二者的肠灌流液浓度以低浓度中各生物碱的浓度为参照。渗透系数Peff测定结果见表5。

332黄连提取物的渗透系数Peff

以中浓度黄连提取物在空肠的渗透系数进行计算，结果见表6。

由以上结果可得，黄连提取物以生物碱类成分进行渗透性分类属于低渗透性，各单一成分的有效渗透系数Peff均低于美托洛尔。在提取物这一多成分环境中，各成分的渗透性提升均不高。

4讨论

黄连提取物中各生物碱的溶解度在pH 10缓冲液中较低，在pH 68以上的碱性环境中各生物碱成分的溶解度显著增大。在pH 74缓冲液中各生物碱单一成分与在提取物中各成分的溶解度均有较为显著的变化。推测除了生物碱成分的相互作用外，黄连提取物中的未知成分也可能存在增溶或减溶作用。而各生物碱单一成分与黄连提取物中各成分的渗透性，除木兰花碱及表小檗碱外，其渗透系数Peff无显著性差异，木兰花碱及表小檗碱的吸收参数有显著差异，但各个生物碱的渗透系数Peff数量级均在10-4级别，且均小于05×10-4 cm·s-1，仍为低渗透性药物。可见，在黄连提取物中各成分的渗透性并未出现数量级的变化，各成分间的相互作用或者提取物中其他未知成分对渗透性的影响不大。

综合黄连提取物的溶解度和渗透性研究结果，黄连提取物在pH 10缓冲液中的溶解度为15693 g·L-1，据此获得的剂量数D0为0201，小于1，属于高溶解度；黄连提取物在空肠的渗透系数为0146×10-4 cm·s-1，低于美托洛尔渗透系数，属于低渗透性，故将黄连提取物归属为CMMBCS Ⅲ类。本研究在进一步丰富和完善CMMBCS顶层研究的同时，还可挖掘出从单一成分固有性质到多成分环境下变化的CMMBCS的本质特色属性，对评价中药成分的吸收情况及证实成分配伍影响吸收的趋势提供基础依据。通过成分间生物药剂学的关系研究，为今后优化出相互促进的多成分物质基础组分及现代中药创新品种的开发提供研发体系、科研模式的基础推动作用。

[参考文献]

[1]Amidon G L， Lennerns H， Shah V P， et al. A theoretical basis for a biopharmaceutic drug classification：the correlation of in vitro， drug product dissolution and in vivo， bioavailability [J]. Pharmaceut Res， 1995， 12（3）：413.

[2]Yu L X， Lipka E， Crison J R， et al. Transport approaches to the biopharmaceutical design of oral drug delivery systems：prediction of intestinal absorption[J]. Advan Drug Delivery Rev， 1996， 19（3）：359.

[3]Oh D M， Curl R L， Amidon G L Estimating the fraction dose absorbed from suspensions of poorly soluble compounds in humans：a mathematical model[J]. Pharmaceut Res， 1993， 10（2）：264.

[4]斯陆勤，黄建耿，李高生物药剂学分类系统及其应用（上）[J]. 中国药师， 2008（2）：163.

[5]刘洋，隗丽，董玲，等多成分体系下中药生物药剂学分类系统的构建分析[J]. 中国中药杂志， 2014， 39（23）：4479.

[6]Li H， Dong L， Liu Y， et al. Biopharmaceutics classification of puerarin and comparison of perfusion approaches in rats [J]. Int J Pharm， 2014， 466（2）：133.

[7]侯成波，汪國鹏，张强，等中药生物药剂学分类系统中多成分环境对葛根素溶解度的影响[J]. 中国中药杂志，2014，39（23）：4499.

[8]刘洋，王刚，董玲，等中药生物药剂学分类系统中多成分环境对葛根素渗透性的影响[J]. 中国中药杂志， 2014， 39（23）：4505.

[9]隗丽，朱美玲，董月柳，等盐酸小檗碱在黄连水煎液中的生物药剂学分类系统属性研究[J]. 中国中药杂志， 2016， 41（7）：1192.

[10]刘洋，朱美玲，孙慧娟，等葛根芩连汤中小檗碱的中药生物药剂学分类系统属性研究[J]. 中国中药杂志， 2017，42（8）：1545.

[11]刘洋，隗丽，李雪莲，等离体法及在体法对黄连水煎液中肠吸收多成分的初步研究[J]. 中国中药杂志，2017，42（8）：1551.

[12]Martinez M N， Amidon G L A mechanistic approach to understanding the factors affecting drug absorption：a review of fundamentals[J]. J Clin Pharmacol， 2002， 42（6）：620.

[13]Waldmann S， Almukainzi M， Bouchacra N A， et al. Provisional biopharmaceutical classification of some common herbs used in western medicine[J]. Mol Pharm， 2012， 9（4）：815.

[14]Zhang J， Liu D， Huang Y， et al. Biopharmaceutics classification and intestinal absorption study of apigenin [J]. Int J Pharm， 2012， 436（1/2）：311.

[15]ZakeriMilani P， BarzegarJalali M， Azimi M， et al. Biopharmaceutical classification of drugs using intrinsic dissolution rate （IDR） and rat intestinal permeability [J]. Eur J Pharm Biopharm， 2009， 73（1）：102

[责任编辑孔晶晶]endprint