全自动体外模拟瘤胃发酵系统：19 kPa以下排气压力不影响发酵特征

龙栋磊 文江南 王 敏 王 荣 张秀敏 毛宏祥 邓近平,4* 谭支良

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128；2.湖南畜禽安全生产协同创新中心，长沙 410128；3.中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125；4.华南农业大学动物科学学院，广州 510640)

全自动体外模拟瘤胃发酵系统：19 kPa以下排气压力不影响发酵特征

龙栋磊1,2文江南1王 敏2,3*王 荣1张秀敏3毛宏祥1邓近平1,4*谭支良3

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128；2.湖南畜禽安全生产协同创新中心，长沙 410128；3.中国科学院亚热带农业生态研究所，长沙 410125；4.华南农业大学动物科学学院，广州 510640)

本试验旨在研究不同排气压力对体外模拟瘤胃发酵特征的影响。选用3只体重相近、装有永久性瘤胃瘘管的成年湘东黑山羊作为瘤胃液供体动物，利用全自动体外模拟瘤胃发酵系统，选用6种发酵底物进行48 h体外发酵，研究9、14和19 kPa 3种排气压力对总产气量、甲烷产量、产气参数、干物质消失率、发酵液pH以及挥发性脂肪酸产量等发酵参数的影响。结果表明：发酵底物对体外模拟瘤胃发酵参数影响显著(P<0.05)；排气压力对体外模拟瘤胃发酵参数没有显著影响(P>0.05)。由此可见，排气压力由9 kPa增至19 kPa对体外模拟瘤胃发酵特征无影响。

排气压力；体外发酵；气体生成；挥发性脂肪酸

瘤胃消化一直是反刍动物营养领域的研究重点，也是国内外研究热点。评价反刍动物饲料饲草营养价值的方法主要有体内法、半体内法和体外法，其中体外法又称人工瘤胃法。人工瘤胃法操作简单，省时省力，可以在较短时间内评价大量饲料饲草样品，而且基本不受动物数量限制，反应条件易于调控，重复性好，易于标准化，因而在反刍动物饲料饲草营养价值评价中得到了广泛应用[1-2]。

人工瘤胃法最早由Raab等[3]和Menke等[4]建立，是目前用来评价反刍动物饲料饲草营养价值的关键技术之一，并且他们最先将100 mL注射器应用于模拟瘤胃体外产气研究。随后压力传感器被应用于模拟瘤胃产气技术中，即借助压力传感器测定发酵瓶气体压力，采用特定软件记录发酵瓶压力来估算体外总产气[5]。科学家还研制出半自动定点实时记录系统[6-7]，即手动型或自动定点测定产气量和采集排气样品。近几年，随着计算机控制程序的引入，本研究团队研制了全自动体外模拟瘤胃发酵系统。

全自动体外模拟瘤胃发酵系统可对发酵瓶压力进行实时在线监测，到达一定压力时自动放气，所排放的气体进入气相色谱仪测定甲烷(CH4)和氢气(H2)等组分[8]。本系统进行体外模拟瘤胃发酵时，为满足足够的气体进入气相色谱仪测定气体组分，设定的排气压力一般是9 kPa。在使用全自动体外模拟瘤胃发酵系统时每批次使用40个发酵瓶，但是系统每次只能允许1个发酵瓶排气进入气相色谱仪测定气体组分。所以，有些达到排气压力的发酵瓶只能等待之前发酵瓶排气结束之后再排气，这时等待排气的发酵瓶的压力会持续增加。当该系统40个发酵瓶同时达到排气压力时，最后排气的发酵瓶压力可达到19 kPa左右。这给本体外模拟瘤胃发酵系统带来了一个问题，即排气压力增加(9～19 kPa)会不会给本系统带来一个新的影响因子。

目前，国内外已有相关报告研究发酵瓶压力对体外模拟瘤胃发酵的影响。Theodorou等[9]研究表明，当发酵瓶压力达到48 kPa时，瘤胃微生物受到抑制从而影响发酵特征。Cattani等[10]研究表明，与固定排气压力(3.4 kPa)相比，固定时间排气导致发酵瓶压力增大(最高可达23 kPa)进而增大发酵气体在发酵液中的溶解量，使得总产气量测定值偏低。但是，9～19 kPa排气压力对体外模拟瘤胃发酵特征的影响目前还没有深入研究。因此，本试验利用自主研制的全自动体外模拟瘤胃发酵系统(专利号：ZL2014102054006)，设置9、14和19 kPa的3个排气压力梯度，探究排气压力增加对体外模拟瘤胃发酵特征的影响。

1 材料与方法

1.1试验供体动物及饲粮

选用3只成年、平均体重(20±2.5) kg、雄性去势并装有永久性瘤胃瘘管的湘东黑山羊作为瘤胃液供体动物。试验动物基础饲粮由水稻秸秆和精料补充料组成，饲粮精粗比为40∶60，每天饲喂精饲料200 g，粗饲料300 g。山羊精饲料参照我国《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)配制，精饲料组成为玉米47%、豆粕24%、麸皮22%、食盐0.77%、石粉2.23%、预混料4%。每只瘘管羊每天08:00和16:00各等量饲喂1次，试验期内，单笼饲养，自由饮水。

1.2全自动体外模拟瘤胃发酵系统

本试验利用自主研发的全自动体外模拟瘤胃发酵系统进行体外发酵。本系统的设计理念、详细组成部分和运行方法可参考专利ZL2014102054006和Wang等[8]文献。简要介绍如下：本系统由发酵瓶恒温培养箱、压力测定系统、气体组分检测系统和计算机控制系统4部分组成，实现对发酵瓶压力实时在线监测，达到排气压力时自动释放发酵瓶压力，并测定发酵瓶排出气体组分。发酵瓶恒温培养箱主要模拟瘤胃环境，控制发酵瓶在接种后保持适宜温度(39.5 ℃)和一定的振荡频率(50 r/min)。压力测定系统由压力传感器(SMC，日本)和三通电磁阀(SMC，日本)组成，通过压力传感器可以在线监测发酵瓶压力，通过三通电磁阀可以控制发酵瓶适时排气。气体组分检测系统主要为气相色谱仪(安捷伦7890A，美国)，用来检测发酵产生气体中的CH4等气体组分。计算机控制系统控制每个发酵瓶的排气压力，在计算机控制系统页面可以直观看到每个发酵瓶的实时压力和累积压力。模拟瘤胃发酵过程中，发酵瓶通过带针头的导管与三通电磁阀和压力传感器连接，压力传感器与计算机相连接。通过计算机设定三通电磁阀的排气压力并时刻记录发酵瓶压力。当发酵瓶压力达到设定排气压力时，发酵瓶进入排放等待序列。当该发酵瓶之前所有排气结束时，系统就自动打开该发酵瓶的三通电磁阀进行排气。排出气体通过气体导管进入气相色谱仪(安捷伦7890A，美国)，自动触发气相色谱仪工作，检测排放气体中的CH4含量。利用Wang等[11]方法计算CH4产量。

1.3发酵底物及体外模拟瘤胃发酵

选用6种发酵底物，4种粗饲料为菊苣、葛藤、阿巴豆叶和桑叶；2种精饲料为玉米粉和次粉。发酵底物均经过风干、粉碎过1 mm筛片。试验前用分析天平准确称取0.6 g发酵底物加入到150 mL发酵瓶中。参照Menke等[4]的方法配制2.4 L人工瘤胃缓冲液。把配制好的人工瘤胃缓冲液置于恒温磁力搅拌器上加热使其保持在39.5 ℃并持续通入纯二氧化碳(CO2)2 h左右，加入少量硫化钠以保证厌氧环境(以刃天青变成无色来判断)。

通过瘤胃瘘管采集2只晨饲前湘东黑山羊的新鲜瘤胃液于保温杯中，迅速带回实验室。将采集的瘤胃液用6层脱脂纱布过滤，量取600 mL迅速加入到准备好的2.4 L人工瘤胃缓冲液中(瘤胃液与人工瘤胃缓冲液体积比为1∶4)，用磁力搅拌器搅拌以保持瘤胃液与缓冲液混合均匀，制成混合人工瘤胃培养液并保持温度39.5 ℃。利用分液器准确移取60 mL人工瘤胃培养液依次加入到150 mL发酵瓶中，放入恒温培养箱中进行体外模拟瘤胃厌氧发酵。在全自动体外模拟瘤胃发酵系统上设定9、14和19 kPa 3个排气压力。恒温培养箱设定温度为39.5 ℃，振荡频率50 r/min。

接种48 h后，通过操作系统使发酵瓶与压力传感器及气相色谱仪断开连接，迅速将发酵瓶从恒温培养箱取出终止发酵。取2 mL发酵液，在25 100×g、4 ℃条件下离心10 min后，取1 mL上清液体，加入0.1 mL 25%偏磷酸固定，静置15 min后，-20 ℃保存用于测定挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)含量。剩余样品用于测定pH和体外干物质消失率(invitrodry matter disappearance，IVDMD)。本试验做3个批次，每个批次瘤胃液来自2只不同瘘管羊。

1.4样品测定

按照杨胜[12]确定的常规测定方法测定发酵底物的干物质(dry matter，DM)、粗蛋白质(crude protein，CP)、粗脂肪(ether extract，EE)、有机物(organic matter，OM)含量；依照Hall等[13]使用Fibretherm FT12全自动纤维仪(Gerhardt analytical systems, 德国)测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)含量。

用pH计(REX PHS-3C，上海仪器设备厂)迅速依次测定每个发酵瓶中发酵液的pH。发酵液经纱布抽滤，将抽滤后的发酵底物用纱布包好再将其放置铝盒中，在105 ℃烘箱中烘8 h，称量并记录，计算IVDMD。

挥发性脂肪酸含量测定方法参考Wang等[14]的方法。样品在常温下解冻，在25 100×g、4 ℃条件下离心10 min后取0.6 mL上清液装于上机瓶中，利用气相色谱仪(安捷伦7890A，美国)测定发酵液中的各VFA含量。

1.5数据统计

应用非线性软件程序(NLREG)，按照Wang等[15-16]提出的模型对体外模拟瘤胃发酵产气曲线进行拟合。模型及相关参数计算公式如下：

式中：GPt表示t时刻的累积产气量(mL/g)，Vf表示潜在最大产气量(mL/g)；k表示产气速率(h-1)；b表示形状参数。

试验数据用Excel 2010进行初步整理后，采用SPSS 21.0统计软件中一般线性模型进行双因素方差分析，以检验排气压力、发酵底物及其交互作用的显著性差异。因统计结果显示排气压力和发酵底物间没有交互作用，交互作用的显著性差异没有列在表中。另外，本试验着重研究排气压力对体外发酵的影响，各发酵底物之间发酵参数的差异性不是本研究重点，对各底物的发酵特性没有做详细说明。统计结果的显著性差异定义为P<0.05。

2 结 果

2.1发酵底物特征

发酵底物营养成分如表1所示，6种不同发酵底物营养成分差别很大，其中粗饲料的纤维(NDF和ADF)含量普遍高于精饲料。

表1 发酵底物营养成分(干物质基础)

2.2不同排气压力对体外模拟瘤胃发酵总产气量的影响

以葛藤为例，不同排气压力下发酵瓶压力随发酵时间变化曲线如图1所示。设定的排气压力越大，达到排气所需的时间越长；设定的排气压力越小，排气次数越多。体外模拟瘤胃发酵48 h内，设定排气压力为9、14和19 kPa的发酵瓶分别排气11、6和5次。由图1可知，排气主要集中在发酵前期和中期，发酵前36 h排气18次，36～48 h排气4次。

图1 葛藤在不同排气压力下发酵瓶压力随发酵时间变化曲线

由图2可知，把同一排气压力下6种底物发酵总产气量平均，得到不同排气压力下体外模拟瘤胃发酵总产气量随时间变化曲线。由图2可知，在发酵的前12 h内，气体生成曲线斜率最大，产气速率快，产气量迅速上升。但3种排气压力下气体生成曲线基本重合，没有明显差异。随着发酵时间延长，气体生成曲线斜率逐渐变小，产气速率趋于稳定。但由表2可知，发酵底物对体外模拟瘤胃发酵总产气量影响显著(P<0.05)，但排气压力对体外模拟瘤胃发酵总产气量没有显著影响(P>0.05)。

图2 排气压力对体外模拟瘤胃发酵总产气量的影响(6种底物发酵平均值)

2.3排气压力对体外模拟瘤胃发酵CH4生成的影响

不同排气压力下体外模拟瘤胃发酵CH4产量及含量的曲线如图3。由图3可知，不同的排气压力下CH4生成曲线基本重合。但由表3可知，发酵底物对体外模拟瘤胃发酵CH4产量影响显著(P<0.05)，排气压力对体外模拟瘤胃发酵CH4产量和产气速率没有显著影响(P>0.05)。

图3 排气压力对体外模拟瘤胃发酵甲烷产量及含量的影响(6种底物发酵平均值)

2.4排气压力对体外模拟瘤胃发酵IVDMD、pH、VFA产量和组分和影响

由表4可知，发酵底物对体外模拟瘤胃发酵的IVDMD、pH及VFA产量和组分影响显著(P<0.05)，排气压力对体外模拟瘤胃发酵的IVDMD、pH及VFA产量和组分没有显著影响(P>0.05)。

表2 排气压力对体外模拟瘤胃发酵总产气量的影响

表3 排气压力对体外模拟瘤胃发酵甲烷产量的影响

表4 排气压力对体外模拟瘤胃发酵干物质消失率、pH及挥发性脂肪酸产量的影响

3 讨 论

瘤胃发酵产生的气体主要有CO2、CH4和H2。20 ℃、101.3 kPa下，CH4、H2和CO2在纯水中溶解度分别为33.1、18.2和878.0 mg/L。因此，CH4和H2是难溶气体[17]，CO2是易溶气体。体外发酵产生的气体主要是CO2(>80%)，瘤胃液中的溶解气体也主要是CO2。另外，CO2溶解度易受溶液温度、压力和pH等的影响[18]。排气压力可通过影响发酵液溶解CO2含量和发酵瓶压力来影响体外模拟瘤胃发酵。

发酵瓶压力升高可影响体外模拟瘤胃发酵过程中的微生物活性。Theodorou等[9]研究表明，当排气压力大于48 kPa时，瘤胃微生物活性受到抑制，进而减少瘤胃微生物对发酵底物的利用，发酵底物的IVDMD降低。本试验结果表明，排气压力由9 kPa增至19 kPa对IVDMD没有影响。结果说明，19 kPa以下排气压力不足以直接影响瘤胃微生物的活性。

排气压力通过提高发酵瓶压力影响瘤胃液溶解CO2是影响产气量的一个重要影响因子。当排气压力升高时，发酵瓶压力升高，溶解CO2的含量增多，气体CO2逸出减少，从而导致总气体产量偏低[9]。Tagliapietra等[23]研究表明，固定时间排气方式产气量比固定压力产气量少。与固定压力(3.4 kPa)相比，固定时间排气压力可达23 kPa，促进CO2气体溶解，阻碍CO2气体释放，致使总产气量测定值偏低。Lowman[24]研究表明，在4.5 kPa压力下，瘤胃液中CO2不会出现过饱和现象。当排气压力低于9 kPa时，瘤胃液中CO2的溶解度不会变化，但当排气压力大于45 kPa时，CO2溶解度增大，且促进CO2在瘤胃液中产生更多碳酸盐[9]。本试验结果显示，排气压力由9 kPa增至19 kPa对总产气量没有影响。这说明，排气压力由9 kPa增至19 kPa对发酵液溶解CO2含量影响较小。

甲烷菌可以利用H2和CO2合成CH4。当排气压力增加，瘤胃液中溶解CO2含量增大，促进甲烷菌对溶解CO2利用并生成更多CH4[25]。但是，发酵瓶压力过大，会抑制CH4产量。Cattani等[10]研究表明，大于45 kPa的排气压力会抑制甲烷菌活性从而减少CH4产量。Wang等[8]研究表明，45 kPa排气压力虽然没有影响CH4总产量，但降低CH4生成速率。本试验结果显示，9～19 kPa排气压力对CH4产量没有影响。这说明，排气压力由9 kPa增至19 kPa不会直接影响甲烷菌活性从而影响CH4产量。

瘤胃液中的溶解CO2具有一个双重角色，既是基质又是产物[26]。瘤胃溶解CO2通过控制微生物转录及羧酶和脱羧酶的活性，刺激一些瘤胃微生物生长和增殖，从而使这些瘤胃微生物达到一个最佳的生物合成和新陈代谢状态[27-29]。例如，琥珀酸合成受磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)和细胞质CO2所调节[30]，研究表明，当在瘤胃液中溶解CO2增大时(>100 mmol/L)，琥珀酸产量将会达到最大[31]。琥珀酸是丙酸合成前体物[32]，可以促进丙酸生成，导致乙酸/丙酸值降低。另外，溶解CO2在溶液中形成碳酸盐。当瘤胃液中碳酸盐浓度增大时，微生物利用更多的H2来用于生成VFA，提高VFA产量[23]。但是，本试验结果显示，排气压力由9 kPa增至19 kPa对VFA的组成和产量没有影响。这说明，排气压力由9 kPa增至19 kPa不足以影响瘤胃微生物生成VFA途径。

4 结 论

综上所述，排气压力由9 kPa增至19 kPa对发酵液中的溶解CO2含量影响较小，对发酵液pH、IVDMD、总产气量和VFA产量和组成均没有显著影响。本试验条件下所设置的发酵瓶不同排气压力不会影响该自主研发的全自动模拟瘤胃发酵系统所获取试验数据的准确性。

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*Corresponding authors: WANG Min, associate professor, E-mail： mang@isa.ac.cn; DENG Jinping, professor, E-mail： dengjinping@aliyun.com

AutomatedIncubationSysteminVitro:VentingPressureLessThan19kPadidNotAffectFermentationCharacteristics

LONG Donglei1,2WEN Jiangnan1WANG Min2,3*WANG Rong1ZHANG Xiumin3MAO Hongxiang1DENG Jinping1,4*TAN Zhiliang3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.HunanCo-InnovationCenterofAnimalProductionSafety,Changsha410128,China; 3.InstituteofSubtropicalAgriculture,ChineseAcademyofSciences,Changsha410125,China; 4.CollegeofAnimalScience,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510640,China)

The present study was conducted to determine the effect of different venting pressure oninvitrofermentation characteristics. Rumen fluid was collected from three adultXiaongdongblack goats with similar weight and permanent rumen fistula, used automated incubation systeminvitro, and six widely varied substrates were selected for 48 hinvitrofermentation, and three venting pressures (9, 14 and 19 kPa) were performed to investigate the effects of venting pressure oninvitrototal gas production, methane production,invitrodry matter disappearance, fermentation fluid pH and volatile fatty acid production et al. The results showed that fermentation substrate had significant effects oninvitrorumen fermentation parameters (P<0.05); however, venting pressure had no significant effects oninvitrofermentation parameters (P>0.05). In conclusion, venting pressure increase from 9 kPa to 19 kPa do not affect fermentation characteristics.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(11)：4171-4179]

venting pressure;invitrofermentation; gas production; volatile fatty acids

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.11.041

S816.6

A

1006-267X(2017)11-4171-09

2017-05-03

国家自然科学基金项目(31561143009，31472133)；国家科技计划项目(2016YFD0500504)；湖南省科技计划项目(2015WK3043)；中国科学院青年促进会项目

龙栋磊(1991—)，男，湖南邵阳人，硕士研究生，从事反刍动物营养与繁殖研究。E-mail: 15073147518@163.com

*通信作者：王 敏，副研究员，E-mail： mang@isa.ac.cn；邓近平，研究员，博士生导师，E-mail： dengjinping@aliyun.com

(责任编辑 武海龙)