环境样品中抗生素的前处理及检测方法研究进展

金璐，陈品品，王潇，赵昱堃，李得康，冀馨宁，吴楠 通信作者



环境样品中抗生素的前处理及检测方法研究进展

金璐1a，陈品品1a，王潇1a，赵昱堃1a，李得康1a，冀馨宁1b，吴楠1a 通信作者

（1. 天津农学院 a. 工程技术学院，b. 园艺园林学院，天津 300384）

抗生素的大量使用所导致的环境问题日趋严重，亟需建立有效的抗生素分析方法。但环境样品成分复杂，且抗生素浓度常处于痕量水平，通常需要经过复杂的提取、净化、浓缩等前处理过程才能进行分析测定。本文系统阐述了环境样品中抗生素的各类前处理和检测方法的原理、应用及优缺点，并对未来的趋势进行展望。

环境样品；抗生素；前处理方法；检测方法

抗生素（antibiotics）自20世纪被发现以来，被广泛应用于临床医疗和畜禽养殖业。但抗生素的大量使用所导致的环境污染问题日趋严重，除了会造成化学污染外，还可能会加速环境中抗生素耐药性的传播和扩散[1]。环境样品中抗生素残留的检测是目前环境健康安全评价中的重要课题。但环境基质成分复杂，干扰物质多，抗生素种类繁多且残留浓度低，给环境样品中抗生素的测定带来很大难度。本文对不同环境基质中抗生素的预处理和检测方法进行综述，旨在为相关研究提供方法借鉴。

1 环境样品中抗生素的前处理方法

1.1 固相萃取

固相萃取（Solid-Phase Extraction, SPE）是由液-固萃取和液相色谱技术相结合发展而来的，可将其近似地看作一种简单的色谱过程，基于固体吸附剂将目标物吸附，从而实现目标物与干扰物质的分离和富集，较常用的方法是使液体样品通过吸附剂，保留其中待测物，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量溶剂迅速洗脱待测物。也可选择性吸附干扰杂质，而让待测物流出；或同时吸附杂质和待测物，再用合适的溶剂选择性洗脱待测物。SPE的操作步骤一般包括活化（除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境）、上样（将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱内并使组分保留在柱上）、淋洗（最大程度除去干扰物）和洗脱（用小体积的溶剂将待测物洗脱下来并收集）。

例如，马丽丽等[2]用固相萃取-高效液相色谱串联质谱法（SPE-HPLC-MS/MS）同时检测土壤中氟喹诺酮类、四环素类和磺胺类共18种抗生素。其中土样通过含50%乙腈的磷酸盐缓冲液（pH＝3）提取后，以SAX-HLB串联小柱净化富集。目标抗生素添加浓度为200和50 μg/kg时，氟喹诺酮类、四环素类、磺胺类的加标回收率分别为67.2%～89.0%，62.2%～85.4%和55.8%～97.4%。同样方法被用于测定自然水体中5种磺胺类抗生素[3]，试验比较了两种萃取柱（HLB和C18）的富集效果，并对水样的pH值、萃取柱的洗脱溶剂及水样体积进行了优化，回收率为86.8%～97.3%。SPE还被用于分析城市污水处理厂进水和出水中7大类共21种抗生素[4]，在最佳条件下，不同抗生素的回收率在60.5%～109.7％之间。此外，还用于提取畜禽类粪便中土霉素、四环素和金霉素等四环素类抗生素[5]。畜禽粪便首先采用EDTA- Mcllvaine缓冲液提取，再用LC-18固相萃取柱富集抗生素，加标回收率介于51.3%～93.7%之间。

SPE吸附剂种类很多，如C18小柱和HLB小柱常用于抗生素的净化富集。其中HLB小柱吸附剂是由亲脂性二乙烯基苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮2种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，对亲水和疏水化合物都有较强保留能力，回收率相对大。强阴离子交换柱SAX与HLB小柱串联使用时，可去除环境样品中的天然有机质（如腐殖酸），从而减少基质效应的干扰作用。SPE常用的洗脱溶剂有：甲醇、水、乙酸、丙醇、异丁醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、乙醚、苯、甲苯四氯化碳、环己烷、正己烷等。与传统的液-液萃取法相比，SPE可以提高分析物的回收率，更有效地将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程，操作简单。

1.2 固相微萃取

固相微萃取（Solid-Phase Microextraction, SPME）是以熔融石英光导纤维或其他材料为基体支持物，采取“相似相溶”的特点，在其表面涂渍不同性质的高分子固定相薄层，通过直接或顶空方式，对待测物进行提取、富集、进样和解析。然后将富集有待测物的纤维直接转移到仪器（气相或液相色谱）中，通过一定方式解吸附（如热解吸，溶剂解吸），然后进行分离分析。

例如，采用SPME方法对污水处理厂活性污泥中甲砜霉素和氟甲砜霉素进行提取，以活性炭为吸附剂对萃取溶液进行净化，除去溶液中的色素。甲砜霉素和氟甲砜霉素的加标回收率为94.00%～98.07%，检出限（S/N＝3）分别为0.008 4 mg/kg和0.015 mg/kg[6]。庄园等[7]以土霉素为模板分子制备了分子印迹SPME涂层, 同时测定牛奶和水样中四环素、盐酸土霉素和金霉素。3种抗生素在100～1 000 μg/L（牛奶）和10～1 000 μg/L（水样）浓度范围内线性关系良好，相关系数在0.995 9以上，四环素、盐酸土霉素和金霉素的检出限为40～80 μg/L（牛奶）和5～10 μg/L（水样）；加标水平为500 μg/L时，回收率为97.8%～109.0%，相对标准偏差（＝7）分别为5.3%～8.2%（牛奶）、3.7%～6.4%（水样）。SPME结合高效液相色谱被用于检测地下水、土壤及粪便中4种常用磺胺类兽药抗生素[8]，在最佳测试条件下，4种磺胺类抗生素在0.005～10.0 mg/L范围内呈良好的线性关系，线性相关系数均大于0.999 9；磺胺噻唑（ST）、磺胺甲基嘧啶（SM）、磺胺二甲基嘧啶（SM2）和磺胺甲恶唑（SMX）的检出限分别为1.08、3.56、4.63、1.84 ng/L；其中固相微萃取对于地下水样的富集倍数为4 000倍，对实际样品的加标回收率为69.8%～117.6%。

随着研究的深入和方法的不断完善及装置的改进，SPME已逐步扩展到食品、天然产物、医药、生化、毒理等诸多领域。

1.3 加速溶剂萃取

加速溶剂萃取（Accelerated Solvent Extraction, ASE）是在升高温度（50～200 ℃）和压力（1 000～3 000 psi或10.3～20.6 MPa）的条件下，用溶剂萃取固体或半固体样品的新颖前处理方法。温度和压力的提高可增加物质溶解度和物质扩散速率，从而提高萃取效率。结合使用有机溶剂，可快速有效地从基体中萃取各种待测物。

通过优化ASE萃取参数和净化条件, 孙宝利等[9]建立了土壤中4种四环素类抗生素残留的ASE-液相色谱串联质谱测定方法。方法检出限为2.2～3.2 μg/kg，样品加标回收率在60.1%～103.8%之间，相对标准偏差为2.6%～4.8%。唐才明等[10]在测污泥和沉积物中微量抗生素时，对比了ASE和超声波辅助萃取的萃取效率，优化了萃取条件。结果表明，ASE和超声萃取对目标抗生素的萃取效率相当，而50％甲醇溶液在酸性条件下（pH＝2）萃取效果最好。同样，孙奉翠[11]也对比这两种方法对土壤中抗生素的提取效果，ASE方法中，以乙腈-磷酸盐缓冲液为萃取剂，EDTA处理的硅藻土为分散剂，在压力1 500 psi、温度70 ℃、静态萃取10 min、循环1次的参数下完成萃取。超声萃取中，以乙腈-磷酸盐缓冲液为萃取剂，通过振荡混匀、超声和离心完成萃取，残渣反复提取2次。结果发现，ASE法在提取效率、自动化程度及对实验人员身体健康影响等方面均优于超声萃取法，但超声萃取在批量处理方面优于ASE法。

1.4 微波萃取

微波萃取（Microwave Aided Extraction, MAE）的原理是在微波场中，吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使待测物从基体或体系中分离，进入萃取剂中。应尽量选择对微波透明或部分透明的介质作为萃取剂，选择介电常数较小的溶剂，同时要求萃取剂对目标成分要有较强的溶解能力，对萃取成分的后续操作干扰较小。

胡献刚[12]利用MAE提取畜禽粪便中抗生素，并对MAE的各参数（萃取温度、辐射时间、升温时间和提取溶液体积）进行正交设计优化，其中萃取温度对回收率的影响最为明显，如磺胺嘧啶在40 ℃回收率为110％，在60 ℃回收率为40％，磺胺甲恶唑在40 ℃回收率为70％，在60 ℃回收率为29％。四环素类抗生素在100 ℃条件下萃取比在60 ℃下回收率要低。和超声萃取相比，结果表明MAE具有更高的回收率。

与传统的萃取方法相比，MAE设备比较简单、价格低廉、节能、节省溶剂、污染小，表现出良好的发展前景和巨大的应用潜力。

1.5 磁性固相萃取

磁性固相萃取（Magetic Solid Phase Extraction, MSPE），也称为磁纳米-微萃取技术，是以磁性或可磁化的材料作为吸附剂的一种分散固相萃取技术。在MSPE过程中，目标分析物随吸附剂一起迁移，最终通过合适的溶剂洗脱待测物，从而与样品的基质分离开来。国明等[13]用MSPE提取环境水样中6种痕量四环素类抗生素，考察并优化了吸附和解吸条件，确定出最佳萃取条件，萃取后的目标化合物经ZORBAX Eclipse Plus C18柱分离，用HPLC-MS/MS在多反应监测模式下进行检测。在优化条件下，样品加标回收率为80.6%～90.0%，日内和日间相对标准偏差（RSDs）分别为0.6%～2.5%和1.1%～7.1%。

1.6 基质辅助固相分散萃取

基质辅助固相分散萃取（Matrix Assisted Solid Phase Dispersion Extraction, MSPD）是一种较新型的前处理方法，最常用于净化液体或者黏稠样品，对于脂类含量较高的基质也适用。该法通过将样品和填料混合研磨，使样品在固定相颗粒表面均匀分散，从而获得半固态样品，随后进行装柱，并通过不同淋洗液进行洗脱而对目标物进行净化。例如MSPD和HPLC-MS/MS用于分析污泥中10种典型抗生素（磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲氧哒嗪、恩诺沙星、沙拉沙星、达氟沙星和氧四环素），加标回收率为40.15%～114.73%，检出限为0.02～0.28 μg/kg[14]。

总之，环境介质中抗生素的预处理方法多种多样，具有不同的适用范围和各自的优缺点（表1）， 应根据实际情况选取适合的预处理方法，才能保证后续分析的准确性。

表1 环境样品中抗生素前处理方法优缺点

2 抗生素的检测技术

抗生素在环境介质中常以痕量存在（如ng/L、μg/kg级别），且受空间分布影响较大，这给抗生素的检测带来了很大难度。在众多测定方法中，目前较常用的有高效液相色谱、超高效液相色谱、液相色谱-质谱联用技术等。

高效液相色谱（HPLC）以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器（如紫外、荧光检测器）进行分析。例如，高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）检测土壤中磺胺类、四环素类和喹诺酮类抗生素，回收率分别为72.4％～83.6％，55.2％～65.8％和51.6％～57.9％[15]。贺南南等[16]用高效液相色谱-荧光分析法（HPLC-FLD）检测沼液中4种氟喹诺酮类抗生素（FQs），采用乙腈和0.01 mol/L四丁基溴化铵作为流动相，外标法定量。4种FQs在0.002～5.000 mg/L浓度范围内呈现良好线性关系，样品平均回收率在80.4%～105.7%，相对标准偏差为1.0%～5.1%，方法检出限为0.004～0.010 mg/L。HPLC-FLD也被用于检测污泥中的FQs，液态和固态样品中FQs的加标回收率分别达到82%～103%和71%～101%[17]。

液相色谱-质谱联用技术以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统，由于其高灵敏度和定性能力，广泛用于多种基质中抗生素的分析。例如，邰义萍等[18]用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）测定了土壤中四环素、土霉素，金霉素、强力霉素的含量，抗生素浓度范围为 0.11 μg/kg到48.45 μg/kg。Pan等[19]采用LC-MS方法，在猪粪中同时检测5种磺胺类药物、3种四环素类和1种大环内酯，方法回收率为73.0%～110.6％。此外，还有研究采用高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析土壤、粪便和堆肥中的9种抗生素和1种激素，不同样品中的检出限分别为2～10 μg/kg、3～16 μg/kg和5～15 μg/kg，回收率范围为63％～121％[20]。Zhu等[21]也采用HPLC- MS/MS测定了地下水及动物饲养废水中3种四环素类抗生素。使用快速拆分液相色谱-串联质谱法（RRLC-MS/MS），Zhou等[22]在地表水、污水池进水和出水、沉积物、粪便等样品中同时检测11类抗生素，方法检出限在ng/L或ng/g级别，回收率为50％～150％。

随着技术的发展，一些研究采用了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）来分析抗生素，与传统HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度更高，分析时间短，节省溶剂，降低了分析成本。但造价较高，且运行时仪器内部压力过大，易产生相应问题。吴晓凤等[23]采用UPLC-MS/MS同时检测复杂基质中（由猪粪和蘑菇渣混合而成的堆肥原料）3种四环素类抗生素（四环素、土霉素和金霉素）及其代谢产物，以乙腈和0.1%的甲酸水溶液为流动相，在电喷雾正离子模式下，用四级杆串联质谱仪进行定性和定量分析。抗生素及其代谢产物在7 min内完成分离。在0～6 mg/kg DW（Dry weight）浓度范围内，抗生素及其代谢产物的标准曲线线性良好，相关系数2均大于0.996 0，重现性较好（＝11，相对标准偏差均小于15%）。检出限和定量限分别在1.668～17.270 μg/kg和5.561～45.918 μg/kg范围内，表明该方法具有较高的灵敏度。Zheng等[24]也使用该方法分析猪粪施肥的土壤中的四环素，方法检出限为0.6～2.5 μg/kg，回收率为23.3％～159.2％。

3 结论与展望

环境样品中抗生素的检测难题在于抗生素种类繁多且浓度常处于痕量水平，环境基质复杂，前处理方法繁琐，检测方法灵敏性低等。理想的样品前处理方法是不破坏待测组分的形态，减少污染，而且能使待测组分与基质有效分离。同时，高灵敏度、高准确性、低成本的检测手段是保证抗生素残留检测的关键。在实际分析中，应根据环境基质、目标抗生素以及实验条件的不同，选择合适的预处理和检测。此外，建立快速、可靠、廉价的抗生素提取和分析方法，以及开发小型的、高效的自动分离及检测装置也是未来研究的热点之一。

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责任编辑：杨霞

Pretreatment and Detection Methods of Antibiotics in Environmental Samples

JIN Lu1a, CHEN Pin-pin1a, WANG Xiao1a, ZHAO Yu-kun1a, LI De-kang1a, JI Xin-ning1b, WU Nan1a Corresponding Author

（1. Tianjin Agricultural University, a. College of Engineering and Technology, b. College of Horticulture and Landscape, Tianjin 300384, China）

The environmental problems caused by the extensive use of antibiotics are becoming increasingly serious, and it is urgent to establish effective methods for antibiotics analysis. However, due to the complex compositions of environmental samples and trace levels of antibiotics, the samples usually need to go through the complex extraction, purification, concentration and other pretreatment processes before analysis. The principles, applications, advantages and disadvantages of various pretreatment and detection methods of antibiotics in environmental samples are systematically elaborated and future prospects are proposed as well.

environmental samples; antibiotics; pretreatment methods; detection methods

1008-5394（2017）03-0092-05

P641.131；S152.72

A

2017－02－23

天津市大学生创新创业训练计划项目“猪场周边土壤中四环素类和磺胺类抗性基因的多样性研究”（201610061014）；天津市应用基础与前沿技术研究计划一般项目“天津农村土壤中抗生素和抗性基因污染物特征的研究”（14JCYBJC43700）；国家自然科学基金项目“猪粪中抗生素耐药性在好氧堆肥过程中的消长机制”（21607114）；教育部留学回国人员科研启动基金“高温堆肥对猪粪中四环素类和磺胺类抗生素及抗性基因的去除”（（2015）1098）

金璐（1994－），女，辽宁兴城人，本科在读，主要从事环境与新能源方面的研究。E-mail：740696566@qq.com。

吴楠（1984－），女，天津市人，讲师，博士，主要从事环境污染物方面的研究。E-mail：nwu@tjau.edu.cn。