HPLC法测定茶叶中5种水溶性维生素

薛淼，王娜，2，通信作者，何新益，2



HPLC法测定茶叶中5种水溶性维生素

薛淼1，王娜1，2，通信作者，何新益1，2

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384；2.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384）

比较不同茶类水溶性维生素的含量，通过优化茶样预处理方法和色谱技术，建立一种RP-HPLC检测方法，测定5种不同水溶性维生素。结果表明，饱和醋酸铅溶液沉淀处理茶样溶液，在C18柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm），检测波长为266 nm，流速为1 mL/min，流动相为甲醇和0.03 mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液（pH＝5.5）混合，梯度洗脱的HPLC色谱条件下，茶样中VB1、VB2、VB6、Vc和烟酸5种维生素分离效果好。红茶中维生素C、维生素B1和维生素B2的含量较多，分别为3.69、2.92和5.18 μg/g。绿茶中维生素B6的含量较多，为2.30 μg/g。青茶和绿茶中未检出维生素B1，4种茶叶中均未检出烟酸。该检测方法有效地检测了4种茶叶中的5种水溶性维生素含量，可为茶叶品质控制提供参考。

茶叶；水溶性维生素；HPLC

茶叶作为日常饮品，含有丰富的茶多酚、蛋白质、氨基酸、糖类、矿物元素和多种水溶性维生素。水溶性维生素分为维生素C和B族维生素。不同茶类由于加工工艺不同，维生素含量差异明显。水溶性维生素常用的测定方法有：紫外分光光度法、分子荧光法和HPLC[1]，此外还有毛细管电泳法[2-3]。司雄元等[2]建立了毛细管电泳法同时测定茶叶中多种水溶性维生素的方法，并对茶树顶芽和叶片中7种水溶性维生素进行对比，结果表明茶树芽顶中的水溶性维生素含量最高。吴艳艳等[4]应用HPLC法建立以草酸为流动相的等比洗脱测定铁观音茶叶和茶茎中维生素C的含量，结果表明铁观音中维生素C的含量高于茶茎中维生素C的含量。郭玉华等[5]采用HPLC梯度洗脱，以磷酸二氢钾为流动相测定茶叶中5种水溶性维生素，结果表明普洱和毛尖中维生素C的含量最高，其中烟酸未检出。紫外分光光度法干扰严重，不能实现同时测定，需要合适的样品前处理。分子荧光法测定维生素的灵敏度相对较高，但应用范围窄。毛细管电泳法成本虽低但分离度较差，并且设备投资大。用HPLC法进行定量分析时，一次可测多种组份的含量，具有分析速度快、分离效能高、灵敏度高的特点[6-10]。

中国按加工工艺将茶叶分为6大茶系，分别为绿茶、青茶、红茶、黑茶、白茶和黄茶。近几年来，茶叶中水溶性维生素的检测报道主要集中在绿茶和黑茶，对青茶和红茶的测定报道较少。不同地域的饮茶习惯不同，北方地区日常消费较多的4大茶类为绿茶、青茶、红茶和黑茶。本文以绿茶、青茶、红茶和黑茶为研究对象，通过对茶样预处理方法和色谱条件进行优化，利用HPLC法测定4种茶叶中5种水溶性维生素，为不同加工工艺对茶叶中水溶性维生素的影响提供一种快速、有效的检测方法和参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

绿茶、青茶、红茶、黑茶，购于天津市南开区华苑茶城。

盐酸、醋酸铅、无水乙酸钠、冰乙酸均为分析纯；甲醇为特优级品，购于天津康巢科技开发有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平：FA1104A型，上海精密科学仪器有限公司；pH计：PHS-3C型，广州市新英电器有限公司；数控超声波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司；数显鼓风干燥箱：GZX-9076 MBE型，上海博迅实业有限公司；半制备液相色谱：Agilent 1200型，Agilent公司；电热恒温水浴锅：HHS型，天津市华北实验仪器有限公司；高速冷冻离心机：Z323K型，Hermle公司；移液针：D12-B3827型，Agilent公司；移液枪：SA714A10006型，北京东林昌盛生物科技有限公司；Prevail C18：Female（B），Grace公司；C18柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm）。

1.3 维生素标准储备液的配制

分别吸取0.05、0.10、0.30、0.50、0.80 mL的100 μg/mLVB1、VB6、VC、烟酸储备液和0.05、0.10、0.20、0.40、0.50 mL的20 μg/mLVB2储备液于10 mL容量瓶中，用0.01 mol/L盐酸定容，作为混合标准储备液。

1.4 样品预处理

青茶、绿茶、红茶和黑茶用高速万能粉碎机粉碎至40目，备用。准确称取1 g的茶样于试管中，加入10 mL的0.01 mol/L的盐酸溶液摇匀浸泡，超声波振荡10 min。取上层清液于离心管内，加入饱和醋酸铅溶液静置30 min，使样品充分反应，沉淀，用离心机以3 000 r/min离心10 min，取上层清液。用0.22 μm有机系微孔滤膜过滤。

1.5 色谱条件的选择试验

1.5.1 洗脱方式的选择

采用乙酸钠-乙酸缓冲液，测试了2种洗脱方式，以青茶作为测试样，其中流动相A为0.03 mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液（pH＝5.5），流动相B为甲醇。测试条件见表1。

表1 洗脱方式的测试条件

1.5.2 流动相组成的选择

采用1.5.1中梯度洗脱的方法测试了3种流动相，以青茶作为测试样，测试条件见表2。

表2 流动相的测试条件

1.5.3 茶样维生素的计算

本文采用外标法[11]对茶样中水溶性维生素的含量进行计算。每个试样测定3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 流动相对分离效果的影响

本文考察了甲醇/草酸和甲醇/磷酸二氢钾作为流动相，其中草酸流动相的分离色谱图出现倒峰，不利于计算。磷酸二氢钾流动相的分离效果好，但由于环境原因，易析出结晶，堵塞色谱柱，其保留时间与维生素C的保留时间几乎相同，使误差增大[12]。乙酸钠-乙酸缓冲液为酸性溶液，不会电离并抑制拖尾，同时流动相的分离效果及峰形较好，不易析出结晶，随时可用。故选择0.03 mol/L乙酸钠-乙酸作为流动相。

2.2 洗脱条件对分离效果的影响

测试等比洗脱条件，14 min时出现连峰，分离效果较差，测试过程中多数色谱图出现连峰现象。因此，研究采用流动相体系A为0.03 mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液（pH＝5.5），B为甲醇，从进样时90%的A经10 min线性变化到80%的A，然后再经过20 min线性变化为20%的A，梯度洗脱条件下的分离情况较好，未出现连峰。试验结果见图1、图2。

图1 等比洗脱分离色谱图

图2 梯度洗脱分离色谱图

2.3 5种维生素的回归方程及相关系数

标准维生素混标的色谱图如图3所示。

图3 标准维生素混标色谱图

以标准维生素混标的一系列浓度，按上述色谱条件将每种浓度进样5 μL，水溶性维生素混合标准溶液的出峰顺序依次为维生素C、烟酸、维生素B6、维生素B1和维生素B2，且22 min内5种水溶性维生素完全分离。

对混合标准溶液分离检测，得到以峰面积对标准维生素的浓度的线性回归分析，建立回归方程、相关系数和残留标准误差（表3），结果显示线性关系良好。

表3 5种水溶性维生素的回归方程、相关系数和残留标准误差

2.4 样品分析

在优化后的色谱条件下，对4种茶叶中5种水溶性维生素的含量进行测定，结果见表4。

表4 不同茶叶中五种水溶性维生素的含量 μg/g

注：ND表示未检出

从表4中可以看出，红茶中维生素C、维生素B1、维生素B2的含量均高于其他3类茶叶，而绿茶中维生素B6的含量最高，青茶和绿茶中未检出维生素B1，4种茶叶中均未检出烟酸。贾林艳等[12]测定花茶和绿茶中烟酸、维生素C、B1、B2、B6的实验中，花茶和绿茶中均含有烟酸和维生素C，花茶中维生素B2的含量最高，含量为2.88%，维生素B1和维生素B6未检出。本试验结果与贾林艳等的试验结果存在显著差异，维生素含量存在差异主要与试验方法、仪器、茶叶的加工工艺、生产年份和贮藏条件等条件有关。

3 结论

本文以4种不同茶类的茶叶为材料，采用甲醇和0.03 mol/L乙酸钠-乙酸为流动相，梯度洗脱条件下实现5种水溶性维生素含量的测定，具有分离效果好、检测速度快、操作简便的优点。结果显示不同品种茶叶中水溶性维生素的含量明显不同。研究为不同茶类之间水溶性维生素含量存在显著差异提供佐证，为茶叶加工品质控制及研究维生素在茶叶加工过程中的变化提供一种检测方法。

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[5] 郭玉华，郁有祝. 高效液相色谱法测定茶叶中五种水溶性维生素[J]. 食品研究与开发，2012，33（8）：138-140.

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责任编辑：张爱婷

HPLC Determination of Five Water-soluble Vitamins in Tea

XUE Miao1, WANG Na1,2,Corresponding Author, HE Xin-yi1,2

（1. Colloge of Food Science and Biological Engineering, Tianjin Agricaltural Univercity, Tianjin300384, China；2. Tianjin Engineering Research Center Agricultural Products Processing, Tianjin 300384, China)

A HPLC method was established to determine five kinds of water-soluble vitamins content in different tea. Optimization of tea pretreatment and chromatographic conditions were obtained. Experiments showed that treatment of tea samples solution pretreated with saturated lead acetate solution. The chromatographic separation was achieved by using a C18column with dimension of 4.6 mm×150.0 mm and particle size of 5 μm. A mixture of methanol and NaAC-HAC buffer solution（pH＝5.5）was used as mobile phase. The effluent was monitored at 266 nm, with flow rate of 1 mL/min and gradient elution. The results showed that the separation of VB1, VB2, VB6, Vc and nicotinic acid was the best in the condition of in HPLC samples, the content of vitamin C, vitamin B1 and vitamin B2 in black tea was more, were 3.69、2.92 and 5.18 μg/g. The content of vitamin B6in green tea was more, was 2.30 μg/g. Green tea and Oolong were not detected in vitamin B1. And four kinds of tea were not detected niacin. The method can detect the content of water-soluble vitamins in four kinds of tea, and provide the reference for the quality control of tea.

tea; water-soluble vitamin; HPLC

1008-5394（2017）03-0069-04

Q946.889

A

2017－02－20

科技部科技人员服务企业行动项目“傲绿公司有机糙米茶饮料研发项目”（2009GJA10032）

薛淼（1993－），女，河北唐山人，硕士在读，主要从事农产品加工研究。E-mail：709274003@qq.com。

王娜（1977－），女，天津市人，高级实验师，硕士，主要从事农产品加工研究。E-mail：18575553@qq.com。