lncRNA-HZ5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究

丁向彬，张蔚然，张俊星，王轶敏，刘新峰，郭宏



lncRNA-HZ5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究

丁向彬，张蔚然，张俊星，王轶敏，刘新峰，郭宏

（天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300384）

为探究lncRNA对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程的影响，选取前期测序结果中在牛肌卫星细胞成肌分化前后差异表达且表达丰度较高的lncRNA-HZ5进行成肌分化调控研究，利用qRT-PCR技术对其在牛骨骼肌卫星细胞成肌分化前后的表达变化进行检测，然后设计合成lncRNA-HZ5的siRNA，转染牛骨骼肌卫星细胞，抑制lncRNA-HZ5表达，之后将肌卫星细胞进行成肌分化诱导，通过肌管形成状态和MHC表达水平检测分析lncRNA-HZ5表达水平改变对肌卫星细胞成肌分化过程的影响。结果表明：lncRNA-HZ5在成肌分化前后的表达存在显著差异，干扰lncRNA-HZ5表达后的肌卫星细胞经成肌分化诱导，肌管数量及MHC的表达量均显著高于对照组，说明下调lncRNA-HZ5表达可以显著促进肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明，lncRNA-HZ5可以负调控牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。

lncRNA-HZ5；牛；骨骼肌卫星细胞；成肌分化

肌肉的生长发育过程受遗传因素及各种调控因子共同影响。大量研究表明，非编码 RNA（non-coding RNA，ncRNA）在肌肉发育过程中发挥了重要调控作用。Long non-coding RNA（lncRNA）是一类长度大于200 nt的非编码RNA。已有研究表明，lncRNA具有调控特定生理和病理学过程的生物功能，部分lncRNA参与了X染色体的失活、基因印记、细胞多能性维持和细胞衰亡等重要生命活动[1-5]。研究表明，lncRNA在肌肉发育和肌细胞增殖与分化中均发挥了关键性调控作用[6-7]。目前，大多数lncRNA的功能尚不明确，且缺乏在牛肌卫星细胞成肌分化中相关lncRNA的研究报道。鉴于这种情况，笔者在前期研究中通过RNA-seq技术，对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中差异表达的lncRNA进行了筛选，本研究从这些差异表达lncRNA出发，选取测序结果中表达丰度较高、分化前后差异倍数较大的lncRNA-HZ5进行成肌分化调控研究，探究lncRNA-HZ5在牛肌卫星细胞成肌分化中的作用，以便更深入地了解lncRNA在牛肌肉发育和肌细胞增殖分化过程中的调控作用，为肉牛分子育种和肌损伤修复研究提供参考。

1 材料

1.1 试剂

lncRNA-HZ5的siRNA由广州锐博生物技术有限公司合成；Opti-MEM® Medium、TRIzol、胎牛血清（FBS）、马血清（HS）购自Life Technologies Corporation；X-tremeGENE Transfection Reagent购自Roche公司；DMEM高糖培养基购自Thermo scientific公司；胶原酶Ⅱ购自Sigma Aldrich Corporation；0.25%胰蛋白酶溶液、RIPA buffer购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂购自Takara biotechnology Corporation；All-in-OneTMqPCR Mix购自GeneCopoeia；鼠抗MHC抗体购自美国DSHB；鼠抗GAPDH、HRP标记的goat anti-mouse IgG二抗抗体购自北京中杉金桥公司；高灵敏ECL发光试剂购自上海生物工程有限公司。

1.2 仪器

细胞恒温培养箱（日本三洋电机公司）；倒置显微镜（德国Leica）；Light Cycler® 96实时荧光定量PCR仪（LightCycler 96）（瑞士Roche公司）；PowerPac Basic电泳仪、Mini-Protean Tetra、MiniTyans-Blot Cell、电泳凝胶成像系统ChemiDoc XRS＋（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 牛骨骼肌卫星细胞的培养和诱导分化

牛骨骼肌卫星细胞的培养和成肌诱导分化参照本实验室已建立的方法进行[8-10]。采用胶原酶和胰酶联合消化法分离肌卫星细胞，将5月龄牛胎儿的后肢肌肉用眼科剪充分剪碎，用5 mL 0.2%胶原酶II在37 ℃水浴锅中消化1 h，0.25%胰酶消化30 min，将上述混合液依次过100目、200目和400目细胞筛，离心收集细胞后用培养基重悬，接种到培养皿中，在含有20%胎牛血清的DMEM培养基中进行培养，待细胞生长至80%融合时，加入含有2%马血清的DMEM培养基进行体外成肌诱导分化。

2.2 lncRNA-HZ5染色体定位分析

登陆Ensembl数据库（http://asia.ensembl.org/ index.html），将lncRNA-HZ5序列与牛全基因组序列进行比对，分析lncRNA-HZ5在染色体上的位置。

2.3 牛骨骼肌卫星细胞成肌分化前后lncRNA- HZ5表达的qRT-PCR检测

为验证测序结果的可靠性，提取未分化牛骨骼肌卫星细胞和分化后肌管的RNA，将RNA反转录成cDNA，通过qRT-PCR技术检测肌卫星细胞分化前后lncRNA-HZ5的表达变化。RNA反转录及qRT-PCR检测根据本实验室已建立的方法进行[8,10]。GAPDH作为lncRNA-HZ5 qRT-PCR检测内参，qRT-PCR引物见表1。

表1 lncRNA-HZ5 qRT-PCR检测引物序列

2.4 lncRNA-HZ5 siRNA设计及干扰效果检测

设计合成lncRNA-HZ5的siRNA，将其与阴性对照按照说明书推荐浓度50 nmol/L分别转染牛骨骼肌卫星细胞。将牛骨骼肌卫星细胞分别接种于35 mm细胞培养皿中，用生长培养基进行培养，当细胞生长密度为70%～80%时准备转染，并在转染前1天将培养基更换成无抗生素的生长培养基。根据试剂说明书推荐浓度，在进行转染时，先将培养基更换成无血清的Opti-MEM培养基，将lncRNA-HZ5 siRNA及阴性对照分别混合于50 μL Opti-MEM培养基中，同时将1 μL罗氏转染试剂混合于50 μL Opti-MEM培养基，分别静置5 min，将含lncRNA-HZ5 siRNA及阴性对照的50 μL Opti-MEM培养基分别加入到含罗氏转染试剂的Opti-MEM培养基中，轻柔混匀后，混合液静置20 min，将混合液均匀滴加到35 mm细胞培养皿中，滴加混合液体积以达到相应的终浓度为准。转染lncRNA-HZ5 siRNA及阴性对照24 h后，通过qRT-PCR技术检测干扰lncRNA-HZ5表达后肌卫星细胞中lncRNA-HZ5的表达变化，操作方法同2.3。

2.5 肌管形成状态观察及MHC蛋白水平的Western Blot检测

在35 mm培养皿中培养牛骨骼肌卫星细胞，转染lncRNA-HZ5的siRNA-3，24 h后将培养基换成分化培养基继续培养48 h，对肌卫星细胞进行诱导分化，倒置显微镜观察肌管形成状态，Western Blot检测肌球蛋白重链（MHC）蛋白表达水平。利用RIPA蛋白裂解液裂解并收集转染lncRNA-HZ5 siRNA及阴性对照的全蛋白质，蛋白含量测定及Western Blot操作参照本实验室已建立的方法进行[8,10]。在进行蛋白质SDS-PAGE电泳试验时，蛋白上样量为40 μg，上样蛋白分别与鼠抗MHC一抗（1∶100）和 鼠抗GAPDH一抗（1∶500）在4 ℃条件下孵育过夜，然后与用TBST稀释二抗（HRP标记的goat anti-mouse IgG二抗）在室温下孵育1 h，将膜在室温下暴露于增强化学发光（ECL）试剂中2 min。使用Image Lab 5.0软件（Bio-Rad）进行条带强度的检测和定量。通过将目的条带的灰度除以来自相同样品上的相同印迹上的内参蛋白灰度，将条带归一化。

2.6 统计分析

采用SPSS 17.0软件对试验数据进行分析，数据资料分析以均值±标准差（±）表示，通过检验比较试验组与对照组差异，＜0.05表示有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 lncRNA-HZ5染色体定位分析

结合前期RNA-seq结果，从肌卫星细胞分化前后差异表达的lncRNA中选取表达丰度较高、分化前后差异倍数较大的lncRNA-HZ5进行研究。lncRNA-HZ5的测序长度为4 853 bp，将lncRNA- HZ5的序列在Ensembl数据库进行检索，发现lncRNA-HZ5位于8号染色体（图1）。

图1 lncRNA-HZ5的染色体定位分析

3.2 牛骨骼肌卫星细胞成肌分化前后lncRNA- HZ5表达检测

为验证测序结果的可靠性，本研究提取未分化牛骨骼肌卫星细胞及分化后肌管的RNA，通过qRT-PCR检测分化前后lncRNA-HZ5的表达变化，试验结果见图2。

图2 牛骨骼肌卫星细胞分化前后lncRNA-HZ5表达的qRT-PCR检测

（注：MSCs为未分化肌卫星细胞；myotube为分化后肌管；**与未分化肌卫星细胞比较，＜0.01）

由图2可知，与未分化肌卫星细胞相比，分化后肌管中lncRNA-HZ5的表达量极显著升高，上调了17倍。试验结果表明，lncRNA-HZ5在肌卫星细胞分化前后差异表达倍数较高，提示它们可能在牛肌卫星细胞成肌分化过程中发挥调控作用。

3.3 lncRNA-HZ5 siRNA设计及干扰效果检测

根据lncRNA-HZ5碱基序列，采用siRNA设计软件设计出5条siRNA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-5），将lncRNA-HZ5的上述5条siRNA分别采用脂质体试剂转染牛骨骼肌卫星细胞，转染24 h后，采用qRT-PCR方法检测lncRNA-HZ5的表达，结果见图3。结果表明，siRNA-1和siRNA-3对lncRNA-HZ5的表达具有明显的干扰作用，显著降低了lncRNA-HZ5的表达水平（＜0.05），可以用于lncRNA-HZ5的表达调控研究。

图3 lncRNA-HZ5siRNA设计及干扰效果检测

（注：转染lncRNA-HZ5 siRNA 24 h后qRT-PCR检测lncRNA-HZ5的表达变化，*与对照组比较，0.05）。

3.4 干扰lncRNA-HZ5表达对牛肌卫星细胞成肌分化的影响

为检验lncRNA-HZ5表达水平改变对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的影响，本研究将lncRNA- HZ5的干扰RNA siRNA-3转染牛骨骼肌卫星细胞，24 h后将培养基换成分化培养基继续培养48 h，对肌卫星细胞进行成肌分化诱导。结果表明，与对照相比，转染了siRNA-3的肌卫星细胞经诱导分化48 h后，形成的肌管数量较多，并且较粗壮（图4 A）。Western blot检测表明，干扰lncRNA- HZ5表达后MHC的表达水平要显著高于对照组（图4B）。试验结果表明，下调lncRNA-HZ5能够促进肌卫星细胞成肌分化，说明lncRNA-HZ5可以负调控牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。

图4 干扰lncRNA-HZ5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用

（注：A为转染siRNA-3后牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程的影响；B为转染siRNA-3后对牛骨骼肌卫星细胞分化后肌球蛋白重链（MHC）表达水平的影响；*与对照组比较，0.05）

4 讨论

lncRNA是一类转录本长度超过200 nt的非编码RNA分子，可以在表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等多种层面上调控基因的表达[11]。1ncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。2002年，Okazaki等人在小鼠的全长cDNA测序结果中发现了lncRNA[12]，随后越来越多有生物功能的lncRNAs被报道[13-14]。随着高通量测序技术的发展，动物转录组测序已经鉴定出了数以万计的lncRNA[15]。越来越多的研究表明，lncRNAs具有调控特定生理和病理学过程的生物功能[1-5]。在肌肉发育方面，Mueller 等利用芯片技术分析了小鼠成肌细胞和分化后肌管中的lncRNA，在肌管中发现 9 个上调 10 倍的 lncRNA，其中肌肉特异性表达的 MUNC 位于上游 5 kb 处，下调 MUNC 可以抑制成肌分化，体内敲除 MUNC引起小鼠肌肉再生障碍，表明 MUNC与肌细胞发育分化具有密切的相关性[16]；Ballarino等通过分析小鼠成肌细胞增殖和分化时期的转录本，发现 lnc-31在增殖期C2C12细胞中高表达，成肌分化后明显下调，lnc-31的表达参与维持成肌细胞的增殖，并可以抑制细胞分化[17]。已有研究结果说明，在成肌分化过程中，lncRNA确实发挥了重要调控作用。

到目前为止，绝大部分lncRNA功能仍是未知的，只有小部分的lncRNA功能被研究。骨骼肌的生长发育是一个受多种调节因子和信号通路共同调控的极其复杂的生物学过程，肌卫星细胞在肌肉生长发育和肌肉损伤修复中都发挥了重要作用。目前，在牛肌卫星细胞成肌分化中相关长链非编码RNA的相关研究鲜见报道，在前期研究中，课题组通过RNA-seq技术对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中差异表达的lncRNA进行了鉴定，本研究从这些差异表达lncRNA中选择表达丰度较高的lncRNA-HZ5进行成肌分化调控研究。首先，使用qRT-PCR检测了肌卫星细胞分化前后lncRNA-HZ5的表达变化，结果表明，lncRNA-HZ5在肌卫星细胞分化前后确实存在差异表达，且差异倍数较大，提示它可能在牛肌肉分化过程中发挥了调控作用。为探究lncRNA-HZ5对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的作用，本研究设计出lncRNA- HZ5的siRNA，转染肌卫星细胞干扰lncRNA-HZ5的表达，试验结果表明，抑制lncRNA-HZ5的表达可以促进牛肌卫星细胞的成肌分化过程，说明lncRNA-HZ5可以负调控牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果可以为牛肌肉发育和肌细胞增殖分化中的lncRNA调控机制研究提供参考。

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责任编辑：宗淑萍

Effects of lncRNA-HZ5 on Myogenic Differentiation Process of Bovine Skeletal Muscle Satellite Cells

DING Xiang-bin, ZHANG Wei-ran, ZHANG Jun-xing, WANG Yi-min, LIU Xin-feng, GUO Hong

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to investigate the effects of lncRNA in the myogenic differentiation process of bovine skeletal muscle satellite cells, a highly and differentially expressed lncRNA（lncRNA-HZ5）detected by RNA-seq technique was selected for further research. The expression changes of lncRNA-HZ5 during bovine muscle satellite cells myogenic differentiation process were identified by qRT-PCR. The expression of lncRNA-HZ5 in muscle satellite cells were down regulated by siRNA, then the cells were transferred to differentiation medium, the myogenic process were evaluated by myotube formation and MHC expression levels. The results showed that the expression of lncRNA-HZ5 were significantly changed during bovine muscle satellite cells myogenic differentiation process. The myotube number and MHC expression levels of siRNA transferred group were significantly higher than that of control group. It was found that inhibition of lncRNA-HZ5 expression using siRNA can promoting the myogenic differentiation process of bovine skeletal muscle satellite cells.

lncRNA-HZ5; bovine; skeletal muscle satellite cells; myogenic differentiation

1008-5394（2017）03-0064-05

S823

A

2017-05-05

国家自然科学基金资助项目“牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs的鉴定和功能研究”（31201021）；天津市“131”创新型人才培养计划第二层次人选资助计划项目（无编号）

丁向彬（1978-），男，河南南阳人，副教授，博士，研究方向为动物细胞工程与繁殖生物技术。E-mail：xiangbinding@163.com。