天津地区副溶血弧菌分离株血清型、部分毒力基因的分布和耐药性调查

徐赟霞，赵良炜，吴艳辉，张丽，崔露文



天津地区副溶血弧菌分离株血清型、部分毒力基因的分布和耐药性调查

徐赟霞，赵良炜，吴艳辉，张丽，崔露文

（天津市水生动物疫病预防控制中心，天津 300221）

为了解天津市水产品中副溶血弧菌的主要血清型、毒力因子携带情况和耐药性情况。调查了2015年天津地区海产品中副溶血弧菌的污染状况，并分析了不同来源的副溶血弧菌主要毒力基因、的分布情况及血清分型，对不同血清型的副溶血弧菌进行了耐药性试验。2015年从天津地区9个区县采集样品共计73份，共分离出38株副溶血弧菌，分离率达52%，毒力相关基因分析结果显示，基因携带率为13.2%，阳性率为5.3%；血清分型结果显示，共分出O1、O3、O10三个血清型，其中O1血清型占60%，为主要的血清型；对不同血清型进行了9种药物的MIC试验，结果显示，对喹诺酮类（烟酸诺氟沙星、乳酸诺氟沙星）比较敏感，对磺胺类的磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶钠、新诺明和氨基糖苷类的硫酸新霉素不敏感，对其他抗生素也产生不同程度的耐药，不同血清型的副溶血弧菌对药物的敏感性没有显著差异，在治疗该菌引起的疾病时可以不考虑血清型。结果提示，天津地区海产品副溶血弧菌检出率较高，部分菌株携带毒力基因，研究结果可为深入研究副溶血弧菌的致病性提供基础数据。

副溶血弧菌；血清型；毒力基因；耐药性

副溶血弧菌（）是一种革兰氏阴性嗜盐菌，是危害海水养殖业的主要病原菌之一[1]，可引起人类急性胃炎、创伤感染和败血症[2]。有研究表明，与副溶血弧菌致病力相关的主要毒力因子主要为溶血素类，包括耐热直接溶血素（thermostable direct hemolysin，TDH）、不耐热直接溶血素（thermolabile hemolysin，TLH）和TDH-相关溶血素（TDH-related hemolysin，TRH）[3]。耐热直接溶血素（TDH）和TDH相关溶血素（TRH）分别由和基因编码，它们被认为是副溶血弧菌的主要致病因子。以菌体脂多糖O抗原和荚膜K抗原为基础研究发现，任何细菌都存在多种血清型，同种细菌存在较为广泛的血清同源性，不仅具有一定的血清流行病学意义，且对细菌疾病的特异免疫诊断与预防也具有一定的参考价值。由于海水养殖的卫生条件难以控制，大量的抗菌药物一直用于治疗及预防细菌性感染，结果造成水环境中耐药微生物的出现、耐药性的增加及耐药基因在陆生微生物与人源病原菌的转移传播。副溶血弧菌对抗菌药物也逐渐产生了多种耐药性，对我国食品安全及人类健康存在潜在的威胁，所以有必要开展副溶血弧菌耐药情况的调查。本研究对2015年从天津9个区县患病的鱼虾样品中分离出来的38株副溶血弧菌进行血清分型、毒力基因检测和耐药性调查，了解天津市海产品中副溶血弧菌的毒力和耐药性，为该病的防控提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 菌株

2015年，从天津9个区县海水养殖区域共采集患病的鱼虾样品73份，分离出副溶血弧菌38株，其中，所分离样品根据GB4789.7—2013，用碱性蛋白胨水（APW）增菌培养基预增菌，在 TCBS 选择性培养基上挑取绿色疑似菌落，采用生化鉴定和16SrRNA相结合的方法综合判定是否为副溶血弧菌。副溶血标准菌株CGMCC1.1997购自中国普通微生物菌株保藏中心（CGMCC）。

1.2 方法

1.2.1 毒力基因检测

1.2.1.1 引物合成

本试验所用引物参照FDA 2004 Bacteriological Analytical Manual Online Chapter 9推荐的引物，由金唯智生物科技有限公司合成（表1）。

表1 PCR反应引物对和预扩增片段长度列表

1.2.1.2 细菌基因组提取

参照 Abolmaaty 改良方法[4]提取供试株细菌基因组DNA。

1.2.1.3 副溶血弧菌主要毒力基因的PCR扩增

PCR反应体系为25 µL：10×buffer 2.5 µL；Mg2+（25 mmol/L）1.5 µL；dNTP 2 µL；相应引物F（20 um）1 µL，R（20 um）1 µL；ddH2O 16.35 µL；（5 U/µL，TaKaRa）0.15 µL；DNA模板0.5 µL。基因扩增反应条件见表2。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下拍照记录结果。

表2 不同毒力基因的反应程序

1.2.2 副溶血弧菌血清分型

副溶血弧菌血清分型按照GB4789.7—2013中所述方法进行。所用血清购自天津生物芯片技术有限责任公司，在有效期内使用。

1.2.3 副溶血弧菌药物敏感性测定

1.2.3.1 药物标准品稀释

按照表3的方法对供试9种药物进行溶解，最后定容至50 mL，使药物终浓度达到1 mg/mL。

表3 抗菌药物标准品稀释方法

1.2.3.2 微量稀释法

按 WHO 推荐的肉汤微量稀释法进行，判断标准参照美国临床实验室标准委员会（NCCLS）标准[5]。以副溶血弧菌CGMCC1.1997为质控菌株，分别测定硫酸新霉素、盐酸多西环素、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺嘧啶钠、新诺明、磺胺二甲嘧啶、乳酸诺氟沙星、烟酸诺氟沙星9种抗菌药物对分离鉴定所得的副溶血弧菌的MIC值。

2 结果与分析

2.1 副溶血弧菌在我市污染状况调查

2015年，共采集来自天津9个区县海水养殖区域患病的鱼虾样本73份，共分离出副溶血弧菌38株，各个区县的副溶血弧菌检出率分别为东丽52.9%（9/17），西青77.8%（7/9）、汉沽50.0%（6/12），宝坻50.0%（5/10），静海50.0%（3/6），大港37.5%（3/8），津南33.3%（3/9），宁河100.0%（1/1），武清100.0%（1/1）。

在38株副溶血弧菌中，5月份分离出1株，6月份分离出3株，7月份分离出17株，8月份分离出10株，9月份分离出7株。

2.2 副溶血弧菌毒力相关基因检测结果

对38株副溶血弧菌分离株的检测发现，所有菌株均携带TLH基因（38/38）（图1），与相关报道的一致[6]，证明该基因具有种的特异性，、基因携带率分别为5.3%（2/38）（图2）和13.2%（5/38）（图3）。其中携带TRH的两株副溶血弧菌均来自东丽区，而携带基因的副溶血弧菌，3株来自津南区，2株来自大港区。

图1 部分代表性副溶血弧菌分离株tlh基因的PCR检测

图2 副溶血弧菌分离株trh基因的PCR检测

图3 副溶血弧菌分离株tdh基因的PCR检测

2.3 副溶血弧菌分离株血清学分型结果

对38株副溶血弧菌分离株进行了血清学分型，结果分出3个血清型，分别为O1群占60.5%（23/38），O3群占5.3%（2/38），O10群占26.3%（10/38），有7.9%（3/38）的菌株出现自凝；根据K多价血清又分为O1：KⅢ、O1：KⅣ、O1：KⅤ、O3：KⅢ、O10：KⅢ和O10：KⅤ，结果见表4。

表4 试验菌株的血清学分布

注：表中KUT表示K抗原未分型

2.4 副溶血弧菌体外抗菌药物敏感性试验结果

采用肉汤微量稀释法，对2015年从天津分离出来的35株不同血清型的副溶血弧菌进行了9种抗菌药物的药物敏感性试验，结果见表5。2015年分离出来的副溶血弧菌对喹诺酮类（烟酸诺氟沙星、乳酸诺氟沙星）比较敏感，对磺胺类的磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶钠、新诺明和氨基糖苷类的硫酸新霉素不敏感，对其他抗生素也产生不同程度的耐药。从地区上看，只有4个地区（宝坻区、大港区、津南区、汉沽区）对甲砜霉素敏感，存在着地区差异，其他抗生素所呈现出来的敏感程度没有显著差异（表6）。

表5 天津地区海产品不同血清型的VP分离株耐药性检测结果

表6 2015年天津地区海产品VP分离株耐药性检测结果

3 讨论

本研究结果显示，天津地区副溶血弧菌分离率为52%，低于国内外报道中的68.12%和78.6%[7-8]，检出率与样品类型有关，一般贝类、虾、蟹检出率较高，而鱼的分离率较低[9]。试验调查收集的样品主要为养殖季节患病的鱼和虾，故分离率比报道的要低。从地区分布来看，除了蓟县，其他几个地区都分离出副溶血弧菌，说明副溶血弧菌在我市分布比较广泛。蓟县养殖水源来自北部山区积存的雨水，盐度常年较低，低盐度的养殖水体不利于副溶血弧菌的生存，故未分离获得副溶血弧菌。赵峰等[10]对我国东部沿海城市贝类中副溶血弧菌的分布情况及其血清型和分子特征进行了研究，发现贝类中季节分布明显，夏季显著高于其他季节（＜0.05），这与本试验调查结果显示的7～9月份分离率较其他月份高的结果相一致，我市2013-2014年副溶血弧菌的分离情况也是7-9月份的分离率较其他月份高，说明高温天气利于细菌在海产品中增殖。

在38株副溶血弧菌海产品相关分离株中，TDH阳性携带率为13.2%，有5.3%的菌株携带TRH基因，没有菌株同时携带这两种基因，携带率与国内外报道的基本一致[8，11]，说明天津地区副溶血弧菌广泛存在且具有一定的毒力基因携带率。

38株副溶血弧菌主要分为3个血清型，分别为O1（60.5%）、O3（5.3%）和O10（26.3%），还有7.9%的菌株出现了自凝，与国内有关报道在外环境及水产品等检测的菌株以O1、O4、O5为主的结果不太一致[12-13]，O1群占60.5%，为主要的血清型，但是O10群也占有相当一部分比例，这说明我市水产品中携带的副溶血弧菌血清型具有多样性，且与其他地区血清型分布存在差异。正确的血清学分型可为我市副溶血弧菌流行病学调查和临床用药提供依据，有利于我市预防和控制由该菌引起的疾病。

细菌的药物敏感性测定，特别是最低抑菌浓度测定对指导临床选用最有效的抗生素和最佳给药方案具有重要意义，同时还可对细菌的耐药性进行监测。本实验结果显示，试验菌株对磺胺类的磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶钠、新诺明和氨基糖苷类的硫酸新霉素不敏感，在使用其进行治疗时要考虑疗效，或者选取其他药物作为替代品。同时观察到不同血清型的副溶血弧菌对上述药物的敏感性没有显著差异，在治疗该菌引起的疾病时可以不考虑血清型；从地区上看，只有四个地区对甲砜霉素敏感，存在地区差异性，其他抗生素所呈现出来的敏感程度没有显著差异，说明副溶血弧菌的耐药性在我市还是比较一致，在实际使用过程中还要综合考虑发病动物的生活环境与人为因素的影响。

综上所述，本研究为天津地区副溶血弧菌的流行情况及毒力基因分布情况提供了参考依据，也为卫生机构和海产品养殖生产者进行安全评估、合理用药并且建立有效的预防机制提供参考。

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责任编辑：张爱婷

Identification of Serotype, Main Virulence Factors and Investigation of Drug-resistant ofStrains from Tianjin

XU Yun-xia, ZHAO Liang-wei, WU Yan-hui, ZHANG Li, CUI Lu-wen

（Tianjin Diseases Prevention and Control Center of Aquatic Animals, Tianjin 300221, China）

To investigate the serotype, toxic genes and antibiotics resistance offrom the seafoods in Tianjin. Several aquatic species and enviroments were examined for presence ofin Tianjin of 2015, and some virulence-related genes such as,and serotype were investigated from the isolates, the drug-resistant test was carried out to the different serum type strains of V.P. In 2015, 73 samples from 9 districts and countries were collected from Tianjin, and a total of 38 strains ofwere isolated. The isolation rate about 52% the genes,existed in 13.2% and 5.2% respectively from 38 isolates; The results of serum typing showed that O1, O3 and O10 were separated, and including serotype O1 accounting for 60% of the major serotype. MIC test was carried out on 9 kinds of drugs with different serum type, the result showed that.was sensitived to quinolones (nicotinic acid norfloxacin Injection, norfloxacin lactate), and non-sensitived tosulfadimidine, sulfadiazine sodium, sulfamethoxazole and neomycin sulphate, and other antibiotics also have different degrees of resistance, There was no significant difference between the sensitivity of.in different serotypes of drugs, in the treatment of diseases caused by the strains could not be considered serotype. This study reveals the significant prevalence of.in seafoods with high diversity of virulence genes. Representativeisolates could be used to provide basic data for the further study of the pathogenicity of.

; serotype; virulence factors; drug-resistant

1008-5394（2017）03-0055-04

S43

A

2016-12-14

徐赟霞（1983-），女，天津市人，助理研究员，硕士，研究方向为水产动物疾病方向。联系电话：022-88251062。