当归多糖除蛋白质前后抗氧化活性比较

刘波，王庆奎，邢克智，陈成勋



当归多糖除蛋白质前后抗氧化活性比较

刘波，王庆奎，邢克智通信作者，陈成勋

（天津农学院水产学院天津市水产生态与养殖重点实验室，天津 300384）

本试验比较当归多糖除蛋白质前后的体外抗氧化活性。采用水提醇沉法制备当归粗多糖（CASP），Sevag法除蛋白后得当归多糖（ASP）。用铁氰化钾还原法测定还原力、Fenton法测定羟基自由基清除能力，DPPH法测定自由基清除能力，邻苯三酚自氧化法测定超氧阴离子自由基清除能力。结果表明，CASP和ASP均具有显著的还原力和自由基清除能力（＜0.05）；同浓度下，CASP的还原能力和自由基清除能力显著高于ASP（＜0.05）。但CASP和ASP的还原能力和自由基清除能力显著低于维生素C（＜0.05）。结果提示，CASP和ASP均具有抗氧化能力，CASP的抗氧化能力高于ASP。

当归；多糖；还原力；自由基清除能力

自由基是近年来基础医学和生命科学领域的研究热点，所有需氧生物体内均可产生自由基，是细胞进行正常代谢的副产物。在正常的生理情况下，生物体内自由基处于动态平衡中，适量的自由基能促进细胞增殖，刺激免疫细胞杀灭细菌等。一旦机体受到疾病或外界刺激以及环境变化，平衡被打破，从而产生过量自由基，攻击各种生物分子，引起一系列氧化损伤，如破坏蛋白质和糖类的结构和功能、降解不饱和脂肪酸、破坏碱基，产生突变，核苷酸损伤等[1]。目前，人工合成的抗氧化剂乙氧基喹啉（EQ）、羟基茴香二丁酯（BHA）、二丁基羟基甲苯（BHT）等对自由基的清除效果很好，但近些年来发现一些化学合成的抗氧化剂有一定的毒性，比如BHT会产生致癌物质，能够引发肝脏肥大、染色体变异等，还可抑制人体呼吸酶的活性[2]，从而引起了人们对化学合成的抗氧化剂的不安全感。因此筛选无毒、高效、营养的天然抗氧化剂具有重要的意义。

多糖是生物体内除蛋白质和核酸以外的又一类重要信息分子。有专家预言，“21世纪将是多糖的时代”。许多研究表明，多糖能为生物体提供能量，参与机体的分子识别、细胞粘附与细胞防御等多种机制，并具有多种重要的生物活性和药理作用，如抗癌、抗氧化、抗衰老和提高免疫力等，能够清除自由基，从而减少慢性疾病的发生[3]。当归是伞形科植物当归（）的干燥根，是我国传统常用“补血”中药，当归多糖是从植物当归原料中提取的水溶性多糖，是当归的主要活性成分之一[4]。目前，关于当归多糖在体外抗氧化活性方面的研究已有一些报道。研究表明，经过硫酸化、磷酸化、乙酰化、甲基化4种化学修饰后的当归多糖，均能显著清除DPPH自由基和抑制Fe2+诱发的脂质过氧化反应，并呈现出一定的量效关系[5]。当归多糖与当归总油配伍能清除DPPH自由基[6]，用纤维素酶和果胶酶破坏细胞壁后提取的当归多糖能清除超氧阴离子自由基和羟基自由基[7]。虽然除蛋白后的当归多糖对超氧阴离子自由基、羟基自由基有很强的清除能力[8]，但除蛋白质过程是否影响当归多糖的抗氧化活性尚未见报道。Sevag法能有效去除多糖中游离的蛋白质。蛋白酶法能把与多糖结合的蛋白质水解下来，但不少多糖往往是以糖蛋白的形式发挥其生物活性。因此，本试验采用Sevag法，只去除多糖中游离的蛋白质，保留与多糖结合的蛋白质，比较除蛋白质前后当归多糖的抗氧化活性，为当归多糖抗氧化活性研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

当归购于本地中草药市场，产地甘肃。将自然风干的当归先去除当归中的脂溶性物质，用78%乙醇浸泡7 d，料液比为1∶10，经常搅拌。将78%乙醇浸泡后的当归用水提醇沉法[9]提取CASP。提取后的当归粗多糖采用Sevag法除蛋白[10]。即将当归粗多糖提取液与Sevag试剂（氯仿∶正丁醇＝4∶1）按3∶1比例混合，磁力搅拌45 min，4 500 r/min离心10 min。离心后溶液分为3层，上层为多糖溶液，中层为蛋白质，底层为有机溶剂。取多糖溶液重复上述步骤，直到蛋白质层消失，将多糖溶液冷冻干燥后，即得ASP。

1.2 方法

1.2.1 还原力的测定

采用铁氰化钾还原法[11]检测。向反应体系中分别加入2、4、8、16、32 mg/ mL CASP、ASP和VC，离心（3 000 r/min，10 min），取上清液0.5 mL，加入0.5 mL蒸馏水和0.1 mL 0.1% FeCl3溶液，混合均匀，10 min后测定700 nm的吸光值。

1.2.2 对羟基自由基（·OH）清除率的测定

采用Fenton法[12]，向反应体系中分别加入2、4、8、16、32 mg/mL CASP、ASP和VC，摇匀后在37 ℃水中温育30 min，测定510 nm处的吸光度，平行测定3次，计算清除率。

1.2.3 对DPPH自由基清除率的测定

采用DPPH法[13]分别吸取2、4、6、8、10 mg/mL CASP、ASP和VC2 mL，加入0.02 mmol/L的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）乙醇溶液2 mL，漩涡混匀器混匀，在室温黑暗处放置30 min。以无水乙醇调零，测定517 nm处的吸光值（样品）。同时，测定样品溶液2 mL与乙醇2 mL混合液在517 nm处的吸光值（对照），再测定2 mL DPPH溶液与2 mL乙醇在517 nm处的吸光值（空白）。

DPPH自由基清除率（%）＝[1－（样品－对照）/空白]×100%

1.2.4 对超氧阴离子自由基清除率的测定

采用邻苯三酚自氧化方法[14]并作适当调整，向反应体系中分别加入2、4、8、16、32、64 mg/mL CASP、ASP和VC1 mL，加入4.5 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HC1缓冲液、4.2 mL双蒸水，漩涡混匀后置于水浴锅中（25 ℃，20 min），取出后立即加入25 ℃预热过的7.0 mmol/L邻苯三酚0.3 mL。漩涡混匀后，以10 mmol/L盐酸调零，测定其在325 nm处的吸光值，每隔30 s读取325，共测定5 min。以吸光值为因变量，时间为自变量，作325随时间变化的回归方程，斜率即为邻苯三酚自氧化速率，以蒸馏水代替样品为空白对照的自氧化速率为。

清除率计算公式为：清除率（%）＝（-）/×100%

1.3 数据处理

数据用SPASS 18.0做单因素方差分析，差异显著的（＜0.05）用Duncan’s法做多重比较。数据用平均值±标准误表示，＝3。

2 结果与分析

2.1 还原能力的测定

由表1可以看出，CASP和ASP的还原能力随浓度的升高而显著增强。同一浓度下，CASP的还原能力显著高于ASP，但二者的还原能力均显著低于VC。

表1 CASP、ASP和Vc的还原能力（OD700 nm）

注：同列数据带有不同小写字母的，表示差异显著（＜0.05）；同行数据带有不同大写字母的，表示差异显著（＜0.05），下同

2.2 对羟基自由基（·OH）清除率的测定

由表2可以看出，CASP和ASP对·OH的清除能力随多糖浓度的升高而显著增强。同一浓度下，CASP的清除·OH能力显著高于ASP，但二者的清除·OH能力均显著低于VC。

表2 CASP、ASP和Vc对·OH的清除率

2.3 对超氧阴离子自由基（O·）清除率的测定

表3 CASP、ASP和Vc对O·的清除率

2.4 对DPPH自由基（DPPH·）清除率的测定

由表4可以看出，CASP和ASP对DPPH·的清除能力随浓度的升高而显著增强。在10 mg/mL浓度下，CASP和ASP相比，清除DPPH·能力不显著，其他浓度下，CASP的清除DPPH·能力显著高于ASP，但二者的清除DPPH·能力均显著低于VC。

表4 CASP、ASP和Vc对DPPH.的清除率

3 讨论与结论

水煮醇沉法提取的植物多糖中往往含有蛋白质，这些蛋白质会对多糖的活性检测和结构解析造成干扰。目前植物多糖常用的除蛋白方法有Sevag法、蛋白酶法、三氯乙酸法等[21]。Sevag法除蛋白是利用蛋白质在氯仿中变性的特点，使多糖与蛋白质分层，其操作简单，对多糖结构无影响；三氯乙酸法利用三氯乙酸可沉淀蛋白而提炼蛋白，但由于三氯乙酸酸性较强，在脱蛋白过程中可能会破坏多糖结构[22]；而蛋白酶法除蛋白质比较彻底，在水解游离蛋白质的同时，也会水解下与多糖结合的蛋白质，破坏多糖的原有结构。用Sevag法除蛋白质后，当归多糖中仍含少量蛋白质[9]，说明当归多糖可能是与蛋白质结合的蛋白多糖。为避免当归多糖因除蛋白而造成原有结构的破坏，本试验采用Sevag法除蛋白。

此外，除蛋白质对多糖的抗氧化活性有影响。如去除婆罗子（）多糖[23]、黑牛肝菌（）多糖[24]、桔梗（）多糖[25]中的蛋白质后，抗氧化活性降低。而将银耳（）多糖[26]中的蛋白质去除后，多糖的抗氧化活性显著增强。本试验结果表明，将当归多糖中的蛋白质去除后，多糖的抗氧化活性显著降低。笔者认为，造成当归多糖除蛋白质后抗氧化活性降低的原因可能有：（1）本试验先用无水乙醇浸泡当归，去除当归中大部分的脂溶性物质和色素，再用水煮醇沉法提取的CASP溶液呈浅棕色，说明CASP中还存在部分色素。用Sevag法除蛋白质后，当归多糖溶液几乎无色，说明色素物质也已去除。因此，CASP中存在的少量色素是否对抗氧化活性有影响，有待下一步验证。（2）本试验提取的CASP中含有21.22%的蛋白质，而用Sevag法除蛋白质后，ASP中蛋白质为2.12%[9]，说明CASP中含有19.10%的游离蛋白质。这部分游离蛋白质是否对当归多糖的抗氧化活性有影响，有待进一步验证。

本研究表明，CASP和ASP有较强的还原能力和自由基清除能力，显示出较强的抗氧化活性，CASP的抗氧化活性显著高于ASP。

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责任编辑：张爱婷

Compare of Antioxidant Activity ofPolysaccharide before and after Protein Removing

LIU Bo, WANG Qing-kui, XING Ke-zhiCorresponding Author, CHEN Cheng-xun

（Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

This paper compared the antioxidant activity ofpolysaccharide（ASP）before and after protein removing. Crudepolysaccharide（CASP）was extracted with hot water and precipitated with ethanol. The ASP was obtained by removing protein from CASP by Sevag method. Ferricyanide reduction method, fenton method, DPPH method, and adjacent benzene three phenol autoxidation method were adopted to assay the reduction ability and free radical-scavenging activity. The results showed that CASP and ASP exhibited significant reduction ability and free radical-scavenging activity（＜0.05）. Within the same concentration, the reduction ability and free radical-scavenging activity of CASP were higher than those of ASP（＜0.05）. However, the reduction ability and free radical-scavenging activity of CASP and ASP were feebler than those of ascorbic acid（＜0.05）. These results indicate that CASP and ASP exhibited antioxidant ability, the antioxidant ability of CASP was stronger than that of ASP.

; polysaccharide; reduction ability; free radical-scavenging activity

1008-5394（2017）03-0046-04

R284.2

A

2016-12-05

国家自然科学基金（面上）项目“当归多糖对点带石斑鱼非特异性免疫和抗氧化机理的研究”（31270456）；天津市水产产业技术体系创新团队项目201704专题（无编号）；天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目“肉桂醛提高半滑舌鳎免疫力机理研究”（15JCZDJC33600）

刘波（1992-），男，天津宁河人，硕士在读，主要从事水产养殖方向研究。E-mail：274230345@qq.com。

邢克智（1956-），男，天津市人，教授，学士，主要从事水产养殖方向研究。E-mail：kzxing6668@126.com。