富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌生物学特性影响的研究

张 涵， 张腾腾， 孔 洁， 李艳茹， 张 敏， 李太元

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌生物学特性影响的研究

张 涵， 张腾腾， 孔 洁， 李艳茹， 张 敏， 李太元*

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

为初步研究富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌生物学特性影响，选择乳酸乳球菌、鼠乳杆菌、嗜酸乳杆菌作为受试菌种， 进行蛋白粉对乳酸菌生长增殖影响试验、耐温性试验、酸碱耐受性试验和胆盐耐受性试验以及对乳酸菌产酸的影响试验等。结果显示：蛋白粉具有促进乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌增殖的作用，富硒乳酸蛋白粉对乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适浓度分别为1、3和4 mg/mL，乳酸蛋白粉对其的最适浓度分别为3、6和9 mg/mL；蛋白粉还一定程度的提高了乳酸菌的酸碱耐受性、耐温性和耐胆盐性；还提高了乳酸菌的产酸量。

富硒乳酸蛋白粉；乳酸蛋白粉；乳酸菌；生物学特性；初步研究

硒元素是人体14大微量元素之一，已被联合国粮食与农业组织(Food and Agriculture Organization，FAO)/国际原子能组织(International Atomic Energy Agency，IAEA)/世界卫生组织(World Health Organization，WHO)共同确认为人体必需的一种重要微量元素[1-2]。生物体内，硒(Selenium，Se)是谷光甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GPx)的活性中心元素，而GPx具有清除对机体有害的自由基，防止细胞膜氧化受损的作用[3]。同时GPx能够激发人体免疫球蛋白及抗体的产生，保护细胞膜和染色体，以及保护核糖核酸等大分子生理活性物质的结构和功能，从而提高机体的免疫力[4]。我国3/4地区属于缺硒地区，生物体内的硒大都来源于蔬菜、水果等，但这些天然食品中硒含量普遍偏低，无法满足成人对硒的需求，从而影响人体内硒的含量和代谢[5]。因此，有必要在食物中强化硒含量，向人体补充硒元素。由于无机硒的毒性很强，吸收率又低，因而添加有机硒视为最安全最有效的手段。人工合成有机硒存在技术难度大，成本高等问题，需通过微生物转化等方法获取有机硒。乳酸菌是目前发酵食品生产中普遍使用的菌种，具有促使发酵食品营养丰富，及众多医疗保健作用，是公认的营养保健食品[6]。此外，乳酸菌具有一定的富硒能力，可以通过乳酸菌将硒元素转化为有机硒，富硒乳酸菌蛋白粉具有有机硒和益生菌的双重功效。乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌均属于有益菌，参与合成各种维生素，抑制致病菌群的生长，还可以分解有毒有害物质等。本试验拟用富含富硒乳酸蛋白粉的培养基培养上述3种乳酸菌，并研究富硒乳酸蛋白粉对这3种乳酸菌的生长及部分生物学特性的影响，为进一步将富硒乳酸蛋白粉应用于临床和实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1菌种来源

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis, ATCC：1.247 0)，鼠乳杆菌(Lactobacillusmurinus, ATCC：1.262 6)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus, ATCC：1.185 4)，由延边大学农学院微生物与免疫实验室保存。

1.2药品与试剂

富硒乳酸蛋白粉、乳酸蛋白粉由延边大学农学院动物营养实验室提供；普通肉汤培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；MRS肉汤培养基、琼脂粉等由延边大学农学院动物营养实验室提供。

1.3菌种的复活

于-80 ℃冰箱里取出保存的乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌菌种，置于37 ℃恒温水浴锅中复苏[7]。于无菌超净台内，将菌株分别置于MRS肉汤培养基中，37 ℃恒温，厌氧条件下静置培养48 h。各取200 μL菌液分别接种于MRS固体培养基中，于37 ℃恒温厌氧条件静置培养48 h，置于4 ℃冰箱贮存备用。

1.4菌悬液的制备

于无菌超净台内分别挑取上述MRS固体培养基上大小适宜的单菌落，接种于MRS肉汤培养中，于37 ℃恒温培养箱内厌氧条件培养菌液浓度至TOD600=0.7±0.1[8]，置于4 ℃冰箱内贮存备用。

1.5富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉最适作用浓度的确定

将富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉分别添加到肉汤培养基中至终浓度分别为0、0.1%～0.9%和1%，各取1 mL上述培养液置于试管内高压灭菌。而后于无菌超净台内分别添加制备的3种乳酸菌菌悬液20 μL，于37 ℃厌氧条件下培养48 h。采用倍比例稀释法均匀涂布于MRS培养皿，每个梯度重复3次，计算细菌数量。分析富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉的最适作用浓度[9]。

1.6富硒乳酸菌蛋白粉对乳酸菌耐胆盐能力的影响

配置含有最适浓度的富硒乳酸蛋白粉(标记为F)和对照组乳酸蛋白粉(标记为R)的MRS肉汤培养基，再设空白对照组MRS肉汤(标记为L)，下同。并且分别添加胆至终浓度分别为0和0.1%～0.5%，高压灭菌。于无菌超净台内，分别添加乳酸菌菌悬液20 μL，37 ℃，厌氧培养48 h后。采用倍比例稀释法均匀涂布于MRS培养皿，每个梯度重复3次，计算细菌数量。分析富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉对3种乳酸菌耐胆盐能力的影响。

1.7富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌耐酸碱能力的影响

配置含有最适浓度的富硒乳酸蛋白粉及胆盐浓度的培养基，调整其pH值分别为2、4、6、7、9、10，高压灭菌。于无菌超净台内，分别添加乳酸菌菌悬液20 μL。37 ℃，厌氧条件培养48 h后，采用倍比例稀释法均匀涂布于MRS培养皿，每个梯度重复3次，计算细菌数量。分析富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉对乳酸菌耐酸碱能力的影响。

1.8富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌的温度耐受性的影响

配置含有最适浓度的富硒乳酸蛋白粉、胆盐和最适pH值的培养基，高压灭菌，于无菌超净台内，分别添加乳酸菌菌悬液20 μL。分别置于40、60和80 ℃的恒温水浴锅内，均分别处理10、20和30 min。37 ℃，厌氧条件培养48 h后，采用倍比例稀释法均匀涂布于MRS培养皿，每个梯度重复3次，计算细菌数量。分析富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉对乳酸菌温度耐受性的影响。

1.9富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌生长能力的影响

配置以上条件均为最适的MRS培养基，高压灭菌，于无菌超净台内，分别添加乳酸菌菌悬液0.5 mL。在37 ℃下厌氧培养，每隔3 h取1 mL菌悬液，共培养48 h。采用倍比例稀释法均匀涂布于MRS培养皿，每个梯度重复3次，计算细菌数量。分析富硒乳酸菌蛋白粉和乳酸蛋白粉对乳酸菌生长能力的影响。

1.10富硒乳酸菌蛋白粉对乳酸菌产酸的影响

配置以上条件均为最适的MRS培养基，高压灭菌，于无菌超净台内，分别添加乳酸菌菌悬液0.5 mL。在37 ℃下厌氧培养，每隔3 h取1 mL菌悬液，共培养48 h。分别测定pH值，分析富硒乳酸菌蛋白粉和乳酸蛋白粉对乳酸菌产酸的影响。

2 结果与分析

2.1富硒乳酸蛋白粉浓度对乳酸菌生长的影响

试验结果表明(图1，a～b)，富硒乳酸蛋白粉对乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适浓度分别为1、3和4 mg/mL，乳酸蛋白粉对乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适浓度分别为3、6和9 mg/mL。富硒乳酸蛋白粉在最适浓度下对乳酸菌生长具有促进作用。

图1a 富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌的影响

图1b 乳酸蛋白粉对乳酸菌的影响

2.2富硒乳酸菌蛋白粉对乳酸菌耐胆盐能力的影响

试验结果表明，富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉增加了乳酸乳球菌和嗜酸乳杆菌的胆盐耐受能力，并且富硒乳酸蛋白粉比乳酸蛋白粉的影响力大；富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉增加了鼠乳杆菌的胆盐耐受能力，并且乳酸蛋白粉比富硒乳酸蛋白粉的影响力大(图2)。

图2 蛋白粉对乳酸菌耐胆盐能力的影响

2.3富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌耐酸碱能力的影响

试验结果表明，富硒乳酸蛋白粉增加了乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的酸碱耐受力，在pH值为6、7时，乳酸菌的生长情况最为良好(图3)。

图3 蛋白粉对乳酸菌耐酸碱能力的影响

2.4富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌温度耐受性的影响

试验验结果表明，富硒乳酸蛋白粉增强了乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的温度耐受能力。对于鼠乳杆菌，乳酸蛋白粉组温度耐受能力的提高幅度大于富硒乳酸蛋白粉组(图4)。

图4 富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌温度耐受性的影响

2.5富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌生长能力的影响

试验结果表明，在不同时间段内，蛋白粉对乳酸菌的作用效果不同。富硒乳酸蛋白粉缩短了乳酸乳球菌的适应期(从0～12 h到0～6 h)，增加了乳酸乳球菌的对数增长期(从12～30 h到6～33 h)；富硒乳酸蛋白粉也缩短了鼠乳杆菌的适应期(从0 ～9 h到0～6 h)，增加了鼠乳杆菌的对数增长期(从9～33 h到6～36 h)；富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉增加了嗜酸乳杆菌的适应期(从0～6 h到0～9 h)，缩短了嗜酸乳杆菌的对数增长期(从6～36 h到9～33 h)(图5)。

图5 富硒乳酸蛋白粉对乳酸菌生长能力的影响

2.6富硒乳酸菌蛋白粉对3种乳酸菌产酸的影响

试验结果表明，随着时间的延长，pH值逐渐下降。对于鼠乳杆菌，富硒乳酸蛋白粉组产酸的能力大于乳酸蛋白粉组;对于乳酸乳球菌和嗜酸乳杆菌，乳酸蛋白粉组产酸能力大于富硒乳酸蛋白粉(图6～8)。

图6 蛋白粉对乳酸乳球菌产酸的影响

图7 蛋白粉对鼠乳杆菌产酸的影响

图8 蛋白粉对嗜酸乳杆菌产酸的影响

3 讨论

微生物蛋白作为乳酸菌生长的营养物质，在乳酸菌生长繁殖过程中起着重要的作用。Xia等[10]研究结果表明，保加利亚乳酸杆菌在一定质量浓度的亚硒酸钠溶液中可以富集大量的硒，并且菌体本身能够很好的生长。因此，本试验通过设置0、0.1%～0.9%和1%等10个浓度梯度，来确定富硒乳酸蛋白粉对3种乳酸菌的影响，并且同时确定其对3种乳酸菌的最适作用浓度。结果表明，富硒乳酸菌蛋白粉对3种乳酸菌的生长均有促进作用。富硒乳酸蛋白粉对乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适浓度分别为1、3和4 mg/mL，乳酸蛋白粉对乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适浓度分别为3、6和9 mg/mL。

巩利昌等[11]报道，胆盐随胆汁排至小肠，导致肠道内的胆盐含量增加，抑制了肠内微生物的生长。本试验设置在0、0.1%～0.5%的胆盐浓度下，来确定蛋白粉对3种乳酸菌的影响。结果表明，蛋白粉提高了乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的耐胆盐能力。Smet I D等报道，胆盐是以分子的形式通过被动扩散进入细胞，然后在细胞质中释放氢离子，导致细胞内酸性增强，从而引起细菌死亡。细菌可以利用ATP所生成的H+—三磷酸腺苷来驱逐细胞质内过多的H+，从而减轻胆盐的毒害作用[13]。

田会芹等[12]报道，pH值的改变会引起细胞膜电荷变化，进而影响细菌对营养物质的吸收，抑制了细菌的生长。因此，本试验设置在pH值分别为2、4、6、7、9、10条件下，来确定蛋白粉对3种乳酸菌的影响。试验结果表明，蛋白粉均增加了乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的酸碱耐受性。

乳酸菌的最高耐受加热温度为35～40 ℃。当外界温度过高时，就会抑制乳酸菌的生长。因此，本试验设置在40、60和80 ℃条件下，并分别处理10、20和30 min，来确定蛋白粉对这3种乳酸菌酸碱耐受性的影响。试验结果表明，富硒乳酸蛋白粉增强了乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的温度耐受能力。但对于鼠乳杆菌，乳酸蛋白粉组温度耐受能力的提高幅度要大于富硒乳酸蛋白粉组的提高幅度。

根据Gasson M J等人的研究结果[13]，乳酸菌的生长时间为24～48 h。因此，本试验设计每3 h测1次含菌量，一直测到乳酸菌的生长时间为48 h，同时确定蛋白粉对这3种乳酸菌生长能力的影响。根据试验结果可知，蛋白粉对乳酸乳球菌和鼠乳杆菌的生长有促进作用，但是对于嗜酸乳杆菌的生长有抑制作用。

乳酸菌的一个重要指标是它的产酸功能，酸可使胃内蛋白原激活，同时酸具有强的杀菌作用[14]。因此，本试验设计测乳酸菌的产酸量，每隔3 h测1次，共培养48 h，同时确定蛋白粉对乳酸菌产酸量的影响。本试验结果表明，富硒乳酸蛋白粉和乳酸蛋白粉增加了乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌的产酸能力。

4 结论

富硒乳酸蛋白粉对乳酸乳球菌、鼠乳杆菌和嗜酸乳杆菌均有增菌作用，富硒乳酸蛋白粉对其最适浓度分别为1、3和4 mg/mL，乳酸蛋白粉对其的最适浓度分别为3、6和9 mg/mL；富硒乳酸蛋白粉还一定程度的提高了乳酸菌的酸碱耐受性、温度耐受性和胆盐耐受性；还提高了乳酸菌的产酸量。

[1] 侯小东,蔺新英.硒等微量元素的生物学相关效应的研究进展[J].环境与健康杂志,2007,10:840-841.

[2] 蔡东联,耿姗姗.硒的生理功能与疾病防治[J].微量元素与健康研究,2006(02):58-61.

[3] M arinho S H,A ntunes F,Pinto R E.Role of G lutathione peroxidase and phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase in the reduction of lysophosphoilpid hydroperoxides[J].Free Rad Biol & Med，1997,22:871-883.

[4] 胡群宝,郭宝江.螺旋藻硒多糖对小鼠免疫功能的影响[J].中国海洋药物,2001,20(5):18-20.

[5] 丁文靖,刘力,祝晓蕾.硒酵母的研制及分析[J].食品与发酵工业,1992(5):73-74.

[6] 杨洁彬,郭兴华,张谌，等.乳酸菌—生物学基础及应用[M].北京:中国轻工业出版社,1999:139-142.

[7] 王敏,魏文玲,刘济明.益生菌复合制剂的研制[J].安徽农业科学.2011，39(6):3638-3640,3643.

[8] 孟俊龙,冯翠萍,常明昌，等.香菇多糖抑菌作用的研究[J].山西农业大学学报(自然科学版),2012,32(3):261-264.

[9] 杨凯,段作营,张建华,等.尼泊金庚酯对常见食品污染菌抑制作用的研究[J].食品工业科技,2004,25(2):116-118.

[10] Xia S K,Chen L,Liang J Q.Enriched selenium and its effects on growth and biochemical composition in Lactobacillus bulgericus[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(6):2413-2417.

[11] 巩利昌,马宏鹏,周玉婷，等.胆盐制备工艺的研究/探讨[J].青海科技,2014(4):86-87.

[12] 田会芹,李贤,傅松哲，等.温度及pH值对杀鲑气单胞菌生长的影响研究[J].海洋科学,2015,39(7):7-12.

[13] Gasson M J.Progress and potential in the biotechnology of lactic acid bacteria[J].FEMS Microbiol Rev,1993,12:3-12.

[14] 郭志杰,李杰,李鑫，等.猪源乳酸菌的分离、筛选、鉴定及产酸性能的研究[J].饲料工业,2010,31(20):45-48.

Studyonbiologicalcharacteristicsoflacticacidbacteriaaffectedbyseleniumenrichedlacticacidprotein

ZHANG Han, ZHANG Tengteng, KONG Jie, LI Yanru， ZHANG Min, LI Taiyuan*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

To study preliminarily the influence of selenium enriched lactic acid protein powder on the biological characteristics of lactic acid bacteria,Lactococcuslactis,LactococcusmurinusandLactobacillusacidophilus, were chosen as test strains. The protein powder growth inhibition test, temperature resistance test, pH tolerance test and bile salt tolerance test and production test were carried out in the study. The results showed that the protein powder could promote the proliferation onL.lactis,L.murinusandL.acidophilus. The optimum concentrations of element Se enriched Lactobacillus protein onL.lactis,L.murinusandL.acidophiluswere 1,3 and 4 mg/mL. The optimal concentrations of lactic acid protein powder were 3 mg/mL、6 mg/mL and 9 mg/mL. The protein powder could improve the lactic acid bacteria pH tolerance, temperature tolerance and bile salt resistance, and improve the acid production of lactic acid bacteria.

selenium enriched lactic acid protein powder; lactic acid protein powder; lactic acid bacteria; biological characteristics; preliminary study

2017-05-20

张涵(1993—)，女，吉林通化人，在读硕士，研究方向为动物微生物和免疫学。李太元为通信作者，

E-mail:tyli@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)03-0062-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.011

R285.5

A