笃斯越桔rbcL基因克隆与系统发育分析

苏 强， 赵 晗， 崔百会， 宋冰雪， 宗成文

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

笃斯越桔rbcL基因克隆与系统发育分析

苏 强， 赵 晗， 崔百会， 宋冰雪， 宗成文*

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

以汪清县兰家林场采集的笃斯越桔叶片为样本，采用PCR方法扩增rbcL基因，分析rbcL序列在笃斯越桔及其近缘植物的序列差异，分析其系统发育关系。结果表明：克隆得到的笃斯越桔rbcL基因片段长599 bp，编码199个氨基酸残基。核苷酸多序列比对发现，笃斯越桔与欧洲越桔和小叶越桔在第68和390碱基位置有差异，并从构建的系统发育树中得出笃斯越桔和卵叶越桔首先聚为一类，说明笃斯越桔和卵叶越桔亲缘关系更近。

笃斯越桔；rbcL基因；序列分析；系统发育

笃斯越桔 (Vacciniumuliginosum)是杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)多年生落叶灌木, 一般高度为50～80 cm，果实为蓝紫色小浆果[1]。越桔果实中含有丰富的营养物质，花青素是其中大量存在的一种黄烷醇类多酚类化合物[2]，具有抗氧化、抗炎症、促进视紫红质合成、提高免疫力、抗癌等多种生理功能，具有很高的开发利用价值[2-5]。

DNA条形码(DNA barcoding)是根据生物的遗传物质序列种内变异小于种间变异而实现物种鉴定的一种方法[4]。rbcL基因不具有内含子，位于叶绿体基因组的大单拷贝区，以单拷贝形式存在，已经被广泛应用在绿色植物的系统进化研究中[5]，它具有2种功能，可以催化2种反应：分别是羧化反应和加氧反应[6]。同时迄今为止，已经测定了被子植物、裸子植物、苔藓、海藻、光合细菌等多种不同材料中的rbcL基因序列[7]。

近年来由于过度采摘等原因，群落的破坏日趋严重，笃斯越桔野生资源的合理开发与保护利用等越来越受到人们的重视。该实验室前期研究表明，长白山笃斯越桔种质资源具有在果实大小、果实形状、叶片形状、花色、果皮厚度、株高等具有较高的遗传多样性，但关于用植物DNA条形码研究笃斯越桔遗传进化的研究尚未见报道。本研究对克隆出的rbcL基因片段，利用多序列比对技术分析样本与GenBank中越桔属植物其它样本的序列差异，并进行系统发育树的构建和遗传距离分析，旨在为笃斯越桔的遗传多样性和遗传进化进一步研究奠定基础。

1 材料与仪器

1.1材料

试验所用的材料从汪清兰家林场野外采集，经度E 130°53′54″，纬度N 43°25′37″，海拔高度850 m，收集当年生新鲜嫩叶，经变色硅胶快速干燥后带回实验室内-20 ℃低温保存，备用。

1.2主要试剂

凝胶回收试剂盒(购自北京华越洋公司)，dNTP mixture、10×Buffer、rTaq DNA 聚合酶、pMD18-T载体试剂盒和大肠杆菌DH5α等均购自Takara(大连)工程有限公司，引物，由北京三博远志生物工程有限公司合成。

1.3方法

1.3.1 DNA提取

使用华越洋植物DNA提取试剂盒，以保存的笃斯越桔叶片为材料提取总DNA，步骤按试剂盒中使用说明书进行，检测合格后-20 ℃保存备用。

1.3.2 笃斯越桔rbcL基因的PCR扩增

扩增rbcL序列所用引物正向为 5’-ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3’，反向为 5’-GTAAAATCAAGTCCACCRCG-3’[8]。PCR 反应体系为25 μL：2.5 μL 10×PCR 缓冲液，1 μL dNTP，0.2 μL rTaq 酶，上游和下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，去离子水18.3 μL。扩增程序为 95 ℃预变性 5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后延伸 5 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测。

1.3.3 笃斯越桔rbcL基因的克隆鉴定和测序

利用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化目的条带，并与T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞[9]，送北京三博远志生物工程有限公司进行测序。所有步骤均按说明书进行。

1.3.4 笃斯越桔rbcL基因的序列分析

NCBI在线BLAST对笃斯越桔的rbcL基因序列进行比对，并下载越桔属的相关序列(表1)，采用Clustal X 1.83[10]软件分别进行多序列比对，用GeneDoc[11]软件输出比对结果，采用Mega5.1[12]软件构建越桔属内基于rbcL基因的系统发育树，并进行遗传距离分析。

表1 来源于GenBank的越桔属rbcL序列

2 结果与分析

2.1笃斯越桔rbcL基因PCR扩增和克隆测序结果

以提取的笃斯越桔基因组DNA为模板，利用rbcLF和rbcLR引物进行PCR扩增。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测[13]，在500～750 bp处出现单一清晰明亮的扩增条带(图1)，与GeneBank中查阅到的其它地区笃斯越桔登录号分别为(KX677950)和(JN966056)的rbcL基因片段大小均在500～750 bp内。

回收该条带并进行克隆[14]，送生物公司测序，结果显示，获得了长度为599 bp的笃斯越桔rbcL基因序列，核苷酸序列及所编码的氨基酸序信息如图2所示，共编码了199个氨基酸序列。

图1 笃斯越桔rbcL PCR电泳检测结果

2.2笃斯越桔rbcL基因的多序列比对及遗传距离分析

2.2.1 笃斯越桔rbcL基因的多序列比对

经BLAST[15]核苷酸序列比对，发现本试验中笃斯越桔rbcL基因，与GeneBank[16]中报道登录号为AF421107、KX677950、JN966056的越桔属植物笃斯越桔核苷酸序列一致性达到100%，且GeneBank中报道的笃斯越桔rbcL序列只有这3个，与登录号为KM361028和HF572812的欧洲越桔、登录号为L12625蔓越桔、登录号为KX678178和JN966057的红豆越桔、登录号为KX679271、KX678990、KX678940的小叶越桔、登录号为KX678497和KX678426的卵叶越桔核苷酸序列一致性均达到99%，与登录号为AF419837的红豆越桔核苷酸序列一致性达到98%，说明本试验成功地克隆了笃斯越桔rbcL基因，序列比对结果如图3所示。

图2 笃斯越桔rbcL基因及编码的氨基酸序列

从图3中可以发现，样本序列与红豆越桔、蔓越橘、卵叶越桔在第68个碱基位置都是碱基C，而欧洲越桔和小叶越桔在第68个碱基位置都是碱基A，还发现笃斯越桔rbcL序列与红豆越桔、蔓越橘、卵叶越桔在第390个碱基位置都是碱基G，而欧洲越桔和小叶越桔在第390个碱基位置都是碱基A，因为本试验克隆的只是笃斯越桔rbcL基因部分的DNA序列，所以这2处碱基上的差异还需要进一步探究。

图3 样本序列与越桔属rbcL核苷酸序列多序列比对结果

2.2.2 笃斯越桔与GeneBank中越桔属植物遗传距离分析

采用p-distance[17]法计算遗传距离，结果由表2可见，遗传距离变幅为0.000～0.013，平均遗传距离为0.004。统计表明，105个遗传距离中，有46个大于平均遗传距离，且差异很小，笃斯越桔与14个越桔属样本之间的遗传变异幅度较小，且多数低于平均遗传距离，表明越桔属植物之间遗传差异较小。

表2 基于rbcL序列的越桔属各样本遗传距离

2.3笃斯越桔rbcL基因的系统进化分析

利用MEGA5.1软件生成系统发育树(图4)，对笃斯越桔与下载其他越桔属植物的rbcL基因同源区域的序列进行比对和系统进化分析[18]，结果显示，来自越桔属的笃斯越桔和卵叶越桔首先与本试验样本聚合，然后与欧洲越桔和小叶越桔聚合，最后与红豆越桔聚为一类，说明卵叶越桔与笃斯越桔亲缘关系更近。

图4 基于rbcL序列的越桔属样本NJ系统树

3 讨论与结论

DNA条形码作为一种新的分类系统，能够有效地完善传统进化和分类方法的不足之处，推进全球生物物种系统进化和鉴定的快速发展，其自Hebert于2003年提出后，已经应用于动物、植物、真菌和藻类等的鉴定和系统发育研究中。在植物研究中，RbcL,MatK和ITS是最近使用最普遍的DNA条形码候选序列，但对不同植物科、属或种内还需要进行针对性的研究和探索[19]。到目前为止，rbcl序列已应用于许多分类群的系统发育研究中，从科内(多为远缘属间)到有花植物主要谱系间[20]，甚至是在整个蕨类植物中[21]，以及种子植物谱系间的关系[22]。季红春等[23]关于珙桐的rbcL基因分析结果表明，珙桐编码区氨基酸与烟草、菠菜、玉米、甘薯、拟南芥、水稻、葡萄、地钱和葡萄柚等9个物种的氨基酸同源一致性超过94.13%，其结果还表明，rbcL基因不能用于识别全部物种，但能够用来区分许多同属植物。刘晓庆等[24]关于大豆rbcL基因序列的研究发现，大豆与其他10个物种rbcL基因的核苷酸的同源一致性在85.37%～95.31%，氨基酸的同源一致性在90.87%～96.47%。这表明rbcL基因在核苷酸和氨基酸水平上都具有高度的保守性和同源性，且氨基酸的同源一致性高于核苷酸。本试验通过对笃斯越橘rbcL序列与GeneBank中的14中越桔属植物的多序列比对发现，笃斯越桔rbcL基因与欧洲越剧和小叶越桔在第68和390碱基位置有序列差异，而在这2个位置与红豆越桔、蔓越橘、卵叶越桔没有序列差异，关于笃斯越桔与欧洲越桔和小叶越桔在第68和390碱基位置的差异是否可以用于它们之间的物种鉴定还需要进一步探究，国内关于笃斯越桔rbcL基因还未见报道，本试验旨在为关于笃斯越桔遗传进化研究奠定基础。

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CloningandphylogeneticanalysisofrbcLgeneofVacciniumuliginosum

SU Qiang, ZHAO Han, CUI Baihui, SONG Bingxue, ZONG Chengwen*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Leaves of theVacciniumuliginosumcollected from Wangqing Lanjia forest as materials, therbcLgene was cloned by PCR, and its sequence and phylogenetic relationships in comparison withrbcLsequences from relatedVacciniumplants were analyzed. The results, showed that the length of DNA fragment ofrbcLgene fromVacciniumuliginosumwas 599bp, encoding a peptide fragment comprising of 199 amino acids. The nucleotide sequence isolated here involved two single base differences at the 68th and 390th bases compared the DNA sequences ofrbcLgene fromVacciniummyrtillusandVacciniumparvifolium, respectively. By DNA sequence alignment,Vacciniumuliginosumand Vaccinium ovatum was clustered into the same class in the phylogenetic tree, indicating that theVacciniumuliginosumwas more closely related with Vaccinium ovatum.

Vaccinium uliginosum ;rbcLgene ; sequence analysis ; phylogenetic

2017-06-20

国家自然科学基金项目(31460504)；吉林省科技支撑计划重点项目(20120251)

苏强(1991—)，男，吉林四平人，在读硕士，研究方向为果树生物技术。宗成文为通信作者，

E-mail:zongchengwen@aliyun.com

1004-7999(2017)03-0007-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.002

S722.32

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