婴幼儿食品乳品和 中游离生物素测定方法的优化

胡国华

1.引言

生物素又称为维生素H，属于B族维生素，是含硫的一种维生素。生物素是乳制品重要的营养物质之一，这种维生素参与机体的三大营养代谢，是生物体生长发育必需的一种营养素，它参与有机体多种主要的新陈代谢活动。特别是对婴幼儿及孕产妇有着特殊的重要性，因此在婴幼儿乳制品、孕产妇乳制品及食品营养强化剂中添加生物素是十分必要的。主要的性能与用途有：构成视沉细胞内感光物质、维持上皮组织结构的完整和健全、增强机体免疫反应和抵抗力和维持正常生长发育。

近年来，生物素的发展越来越受到关注，检测的方法也比较多，但每种检测方法的原理、时效、以及针对的产品都各不相同，故在实际应用上，能针对样品的不同而选择合适的生物素检测方法也是至关重要的。常用的生物素检测方法有很多，主要包括微生物法、高效液相色谱法、酶联免疫法、荧光法等。其中微生物的方法是目前应用比较广泛的方法，也是婴幼儿食品和乳品中游离生物素国标检测方法中唯一的检测方法，这个方法主要用于检测样品中生物素含量较低的情况。

此方法灵敏度高，但测试步骤繁琐，工作量大，在用分光光度计读数时要求漩涡混合后立即移入比色皿内进行读数，并且要求每支试管的稳定时间相同，对操作者的熟练程度有较高的要求，一次最多能检测1到3个培养管，检测效率低，也会增加误差，费时费力，因此需要开发一种更简便和实用的检测方法。

2.原理

利用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）对游离生物素的特异性和灵敏性，定量测定出试样中待测物质的含量。在含有除待测物质以外所有营养成分的

培养基中，微生物的生长与待测物质含量呈线性关系，根据透光率与标准工作曲线进行比较，即可计算出试样中待测物质的含量。

3.材料与方法

3.1 材料

3.1.1 菌株：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），ATCC 8014。

3.1.2 生物素（d-Biotin 或Vitamin H）标准品（C10H16N2O3S）：纯度≥99 %。

3.1.3 培养基：乳酸杆菌琼脂培养基；乳酸杆菌肉汤培养基；生物素测定用培养基。

3.1.4 乙醇溶液（50 %）。

3.1.5 硫酸溶液（3 %）：量取3mL 硫酸加入到水中，定容至100 mL。

3.1.6 氢氧化钠溶液（2 mol/L）：称取80 g 氢氧化钠溶于1000 mL 水中。

3.1.7 氯化钠溶液（9 g/L）：称取9.0 g 氯化钠溶解于1000 mL 水中，分装试管，每管10 mL。121℃灭菌15 min。

3.1.8 标准溶液的制备

3.1.8.1 生物素标准贮备液（100 μg/mL）：称取生物素标准品（3.1.2）用乙醇溶液（3.1.4）定容至生物素

浓度为100 μg/mL，贮于冰箱中。

3.1.8.2 生物素标准中间液（1 μg/mL）：吸取1 mL 生物素标准贮备液（3.1.8.1），用乙醇溶液（3.1.4）定容至100 mL。

3.1.8.3 生物素标准工作液（10 ng/mL）：吸取1 mL 生物素标准中间液（3.1.8.2），用乙醇溶液（3.1.4）定容至100 mL。

3.1.8.4 標准曲线工作液：分两个浓度，高浓度溶液的浓度为0.2 ng/mL；低浓度溶液的浓度为0. 1 ng/mL。从工作液中（3.1.8.3）吸取两次各5 mL，用水分别定容到250 mL 和500 mL。

3.2 仪器和设备。

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.2.1 天平：感量为0.1 mg。

3.2.2 pH计：精度≤0.02。

3.2.3 分光光度计。

3.2.4 涡旋混合器。

3.2.5 离心机：转速≥2000 转/分钟。

3.2.6 恒温培养箱：36 ℃ ±1 ℃。

3.2.7 冰箱：2 ℃～5 ℃。

3.2.8 无菌吸管：10 mL （具0.1 mL 刻度） 或微量移液器或吸头。

3.2.9 瓶口分液器：0 mL～10 mL。

3.2.10 锥形瓶：200 mL。

3.2.11 容量瓶（A 类）：100 mL，250 mL，500 mL。

3.2.12 单刻度移液管（A 类）：容量5 mL。

3.2.13 漏斗：直径90 mm。

3.2.14 定量滤纸：直径90 mm。

3.2.15 试管：18mm×180 mm。

注：玻璃仪器使用前，用活性剂（月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可）对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后在200 ℃干热2 h，以去除玻璃器皿中的残留物对试验的影响。

3.3 分析步骤。

3.3.1 接种菌悬液的制备

3.3.1.1 将冻干菌株（3.1.1）活化后，转接到乳酸杆菌琼脂培养基（3.1.3.1）中，36 ℃ ±1 ℃培养过夜。再转接2～3 代来增强活力。然后再将其从固体培养上转接到乳酸杆菌肉汤培养基（3.1.3.2）中培养。

3.3.1.2 将乳酸杆菌肉汤中的培养液以2000 转/分钟离心2 min～3 min，倾出上清液，加入10 mL 氯化钠溶液（3.1.7），混匀，再离心2 min～3 min，如此清洗3 次～4 次，吸适量该菌悬液于10 mL 盐水（3.1.7）中，待测。endprint

3.3.1.3 用分光光度计以氯化钠溶液（3.1.7）做空白，于550 nm 波长下测菌悬液（3.3.1.2）的透光率，使其透光率在60 %～80 %之间。

3.3.2 样品的处理

3.3.2.1 干粉样品

称取一定量样品（精确至0.0001 g）于250 mL 三角瓶中，该样品应含0.2 μg～0.5 μg 生物素，继续3.3.2.3 步骤。

3.3.2.2 液体样品

吸一定量的液体样品于250 mL 三角瓶中，该样品应含0.2 μg～0.5 μg 生物素，继续3.3.2.3 步骤。

3.3.2.3 样品的提取

加入硫酸溶液（3.1.5）100 mL，121 ℃水解30 min，冷却后用氢氧化钠溶液（3.1.6）调节pH 至4.5±0.2，定量转到250 mL 容量瓶中，用水定容，充分混合。用滤纸过滤，弃去最初的几毫升。吸取滤液5 mL，加入约20 mL 水，用氢氧化钠溶液（3.1.6）调pH 为6.8±0.2，定量转到100 mL 容量瓶中，用水定容。

3.3.3 标准曲线的制作

按表1 顺序加入水、标准曲线工作液（3.1.8.4）和生物素测定用培养基（3.1.3.3）于培养管中，一式三份。

3.3.4 待测液的制作

按表2 顺序加水、样品溶液（3.3.2.3）和生物素测定用培养基（3.1.3.3）于培养管内，一式三份。每份样品需带样品空白试管一只，管内分别加入5 mL待测液和5 mL培养基。

3.3.5 灭菌

将3.3.3和3.3.4中所有的试管盖上试管帽，放入高压灭菌锅内，121 ℃灭菌5 min（商品培养基按标签说明进行灭菌）。

3.3.6 接种

从高压灭菌锅内取出试管，将试管迅速冷却至30 ℃以下。将接种菌悬液（3.3.1.2）用滴管或移液器向上述试管中各滴加一滴（约50 μL），其中标准曲线管中未接种空白S1和样品空白除外。

3.3.7 培养

將试管放入培养箱内，36 ℃ ±1 ℃培养19 h～20 h。

3.3.8 测定

对每支试管进行视觉检查，接种空白试管S1 内培养液应是澄清的，如果出现浑浊，则结果无效。

3.3.8.1 以接种空白试管S1 做对照，测定最高浓度标准曲线试管的吸光度，两小时后重新测定。两次结果透光率差值若小于2 %，则取出全部检验管测其吸光度A。

3.3.8.2 以接种空白试管S2 为空白，调节吸光度为0，依次读出其他每支试管的吸光度A，样品空白的吸光度A 一并读出。

3.3.8.3 用涡旋混合器充分混合每一支试管后，立即用两种方法（即分光光度计法和酶标仪法）对各管中的培养液进行吸光度的测量。以生物素标准品的含量为横坐标，吸光度A 为纵坐标作标准曲线。

3.3.8.4 对每个编号的待测液试管，用每支试管的吸光度值计算每毫升该编号待测液生物素的含量，并计算该编号待测液的生物素含量平均值，每支试管测得的该浓度不得超过该平均值的±15%，超过者要舍去。如果符合该要求的管数少于所有四个编号待测液总管数的2/3，需要重新检验。如果符合该要求的管数大于等于原来管数的2/3，重新计算每一编号的有效试样管中每毫升测定液生物素含量的平均值，以此平均值计算全部编号试样管的总平均值Cx，用于计算试样中的生物素含量。

3.3.9 分析结果的表述

试样中生物素的含量按公式 （1） 计算：

（1）

式中：

X——试样中生物素的含量，单位为μg/100 g；

Cx——3.3.8.4中计算所得的总平均值，单位为ng；

m——试样的质量，单位为克g；

f ——稀释倍数。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。

3.3.10 精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。

3.3.11 其他

本标准检出限为20.0 μg/kg。

4.对比结果

5 .结论

随着市场是婴幼儿配方食品和乳品的增多，而生物素又是其中一种必要的添加物，也是国家标准中要求的项目，《GB5413.19-2010食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定》方法用分光光度计进行培养液的测量工作量大，且对操作者的熟练程度有较高的要求，一次最多能检测3个培养管，检测效率低，同时也增加误差。而用酶标仪配合96孔板对培养液进行吸光度的测量时，能将所有试管中的液体放在同一块96孔板中同时进行读数，大大的减少了操作的时间，测试的结果与用分光光度计比较，误差为0.1%。因此，在婴幼儿食品和乳品中的游离生物素测试过程中，用酶标仪取代分光光度计对培养液进行吸光度的测量，可大大的降低人员的工作量，对优化后的检验方法更简便，易于操作，且结果准确可靠，尤其适用于大批量样品中游离生物素的测定。endprint