气质联用法测定市售酱油中氨基甲酸乙酯的含量

吕昱+王立雄+严敏+田仁奎

摘 要：采用固相萃取（SPE）结合气相色谱-质谱联用法建立测定酱油中氨基甲酸乙酯含量的方法，酱油试样经过C18萃取柱净化提纯后，用丙酮-二氯甲烷溶液进行洗脱后进行气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）检测，利用选择离子扫描模式以及外标法进行定性定量分析。氨基甲酸乙酯在1-10μg/mL浓度范围之间线性关系良好，r2=0.9938，检测限为0.014μg/mL，定量限为0.048μg/mL，加标回收率为97.78%（n=6），用这种方法对贵州地区市售酱油中氨基甲酸乙酯的含量检测，结果在340-440μg/mL之间。

关键词：气相色谱-质谱联用；氨基甲酸乙酯；市售酱油；外标法

中图分类号：O658.2 文献标志码：A 文章编号：2095-2945（2017）33-0067-03

1 概述

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是一种具有基因致癌的多位点致癌物质，在2007年2月被国际癌研究机构将其从2B类（“可能令人类患癌的物质”）升级为2A类（“能令人类患癌的物质”）致癌物质[1]，[2]，但是在它被定义为可能致癌物质以前，它曾经在医学上作为抗肿瘤药物和麻醉剂使用过[3]。它是发酵食品（如酱油、腐乳、奶酪）和酒精饮品在发酵过程中的中间产物[4]。

酱油是我国各大菜系中一种传统的调味品，它是用豆、麦或者麸皮酿造的液体调味品，因为这种酿造技术属于发酵工程，在发酵过程中容易发生各种复杂的化学反应，生成如氨基甲酸乙酯、氯丙醇、酚醛类等物质。其中氨基甲酸乙酯这一物质作为一种2A类致癌物质，它具有生物遗传毒性，在进入人体后会对免疫系统造成不可逆的损伤，它在人体内被细胞色素P450氧化后，氧化产物能够诱导Cμ2+调控的DNA发生损伤，从而导致癌变[5]。所以越来越多的国家认识到这种物质的危害性，国际上现行的氨基甲酸乙酯的检测方法是气质联用检测法[6]，我國目前对酱油中氨基甲酸乙酯的含量限定及检测方法尚无标准，本研究以固相萃取结合GC/MS建立一种使用外标法来测定市售酱油中氨基甲酸乙酯的含量的方法，为贵州地区市售酱油中氨基甲酸乙酯的含量限定作一定参考。

2 试验材料、试剂及仪器

正己烷使用液：（色谱纯）天津市化学试剂厂

二氯甲烷使用液：（分析纯）成都金山化学试剂有限公司

甲醇使用液；（分析纯）纯度≥99.5%，天津市富宇精细化工有限公司。

丙酮使用液；（分析纯）天津市康科德科技有限公司

氨基甲酸乙酯标准品；

1号酱油；味莼园牌黄豆酱油，贵阳味莼园食品有限公司

2号酱油；味莼园牌特鲜酱油，贵阳味莼园食品有限公司

3号酱油；味莼园牌卫生酱油，贵阳味莼园食品有限公司

4号酱油；味莼园牌鲜酱油，贵阳味莼园食品有限公司

5号酱油；黄豆酱油，贵阳市白云区酱菜厂

气相色谱-质谱联用仪；安捷伦公司7890A/5975C型GC/MS

实验室专用超纯水机；四川沃特尔科技发展有限公司

固相萃取仪；12位方缸固相萃取装置，月旭材料科技（上海）有限公司

3 实验条件

3.1 仪器条件

进样口温度230℃，初始柱温100℃保持3min，阶升20℃至180℃，后运行230℃保持2min，分流模式，分流比1：10，溶剂延迟2min，全扫描模式。

3.2 固相萃取条件

酱油中成分复杂，基质种类繁多，极容易对检测结果造成干扰，所以在进行仪器分析方法检测含量之前对酱油进行预处理，尽可能的进行分离纯化，将其中所含的EC提取出来[7]。由于氨基甲酸乙酯属于极性易溶于水的物质[7]，为保证酱油中样品检测的回收率，经过实验证明EC需停留在萃取柱中的萃取时间在30min，选择添加丙酮-二氯甲烷（V/V）洗涤液来进行洗脱，而且体积比为1：9的丙酮-二氯甲烷洗脱液过C18萃取小柱时，回收效果最好。

3.3 氨基甲酸乙酯气质联用的定性离子的确定

建立一个氨基甲酸乙酯检测方法，进样口温度230℃，选择分流模式，分流比1：10；柱温：初始100℃，保持3min，后20℃/min上升至180℃，后运行230℃，保持2min，辅助加热器230℃；MS条件：溶剂延迟2min，全扫描模式，全扫描参数开始 30结束450。

以浓度为10μg/mL的EC标准溶夜进样一次，检测得到一个峰型较好的峰图，对质谱图进行Nist谱库检索，谱库检索为氨基甲酸乙酯这一物质，并确定保留时间为5.75min，确定氨基甲酸乙酯的定性离子为44、62、89，总离子流图如图1。

4 试验过程

4.1 标准曲线的绘制

4.1.1 EC标准溶液的配置

用分析天平精密称定100mg在120℃干燥至恒重的EC标准样品，用甲醇定容至100ml得到浓度为1mg/mL的母液（冰箱里3℃存放）；准确吸取1000μL母液于100mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度，所得溶液即浓度为10μg/mL的标准溶液。

4.1.2 梯度浓度的EC标液的配置

准确量取100μL、1000μL、2000μL、5000μL、10000μL浓度为10μg/mL的EC标准溶液置于10mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度，即为0.1μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的EC标准溶液。

4.1.3 标准曲线的制作：按照3.3的方法分别进样5个不同浓度的EC标液，然后以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标建立标准曲线。

4.2 样品处理

称取1号市售酱油5mL于干燥洁净的烧杯中，对固相萃取柱作如下处理，将固相萃取柱装上样，依次用2mL甲醇和正己烷活化萃取小柱，接着再用4mL纯化水平衡萃取小柱。将烧杯中的酱油倒入萃取小柱中抽真空，让酱油停留在萃取小柱中保持30min，然后将萃取小柱上的酱油缓慢抽到废液管中，再用正己烷淋洗以洗去杂质，最后用1：9丙酮-二氯甲烷洗脱液以自然流速洗脱，洗脱液置于45℃恒温水浴锅中浓缩至0.3mL左右，转移至进样瓶中并用甲醇加至1mL，对2到5号酱油同操作。endprint

4.3 酱油中氨基甲酸乙酯含量的测定

将4.4中的1至6号酱油处理液用标签纸做好相应标记，按顺序放入GC/MS自动进样器的旋转盘上。调用方法，并且改变MS扫描模式为离子扫描模式，离子扫描参数44、62、89。分别进样1至5号进样瓶，检测五个样品中的氨基甲酸乙酯含量，每个样品瓶分别进样6次。

4.4 加标回收率试验

取2号酱油样品（含量约0.43μg/mL）1mL，分别添加0.5μg/mL和0.75μg/mL和1.0μg/mL的EC标准溶液各1mL，每个浓度的标准溶液都添加三份，共九份，按照3.3项下的检测方法进行检测，检测出加标后的测定值。

加标回收率公式：加标回收率=（加标试样测定值-试样测定值）/加标量×100%。

4.5 精密度实验

取5号酱油处理液，连续六次测定数据，计算相对标准偏差。

4.6 线性范围

取浓度为10μg/mL的EC标准溶夜，GC/MS进样1μL，选择离子扫描模式检测，以62离子作为定量离子峰，以氨基甲酸乙酯浓度为横坐标，62离子强度为纵坐标做标准曲线[8]，在安捷伦工作站里建立曲线校正方法，得出它的线性条件和线性范围。

4.7 检测限的测定

取浓度为2μg/mL的氨基甲酸乙酯标准液，GC/MS进样1μL，对其进行性能报告分析，然后根据信噪比公式D=3S/N，由此推算出学院GC/MS仪器用这种方法检测氨基甲酸乙酯的检测限。

5 结果分析

由实验结果可知氨基甲酸乙酯标准溶液在1-10μg/mL浓度范围之间线性关系良好，实验所得线性方程为Y=2.906X-7.925（r2=0.9938）。

由性能报告峰谱图89，所以其检测限应该为0.014μg/mL，按照信噪比S/N为10得出定量限为0.048μg/mL。

回收率实验的结果分析

平均回收率为97.78%，RSD为2.59%，表明该方法准确度较高，可以准确地检测出酱油中的氨基甲酸乙酯的含量。

精密度实验结果分析

5号酱油的相对标准偏差RSD（n=6）为6.5%，表明该仪器精密度良好。

市售酱油中的氨基甲酸乙酯含量确定

贵州地区5种市售酱油结果见表1，表明1至4号酱油中氨基甲酸乙酯浓度较5号酱油中的多。

6 结束语

经过固相萃取和液液萃取的结果分析，该方法用到固相萃取对酱油进行净化和提纯是因为EC这一物质在C18萃取柱中溶解度比在液体中的溶解度高，固相萃取法能有效分离提取酱油中EC。经过GC/MS仪器检测后，利用系统自带的质谱可以轻易的发现EC这一物质，虽然学院的气质联用仪在这个实验中检验的质谱和标准谱库中的EC质朴图并不完全一样，但是这是由于EC的物质结构和我们所用的质谱检测器的检测原理不同而造成的[9]，这并不影响实验结果。

GC/MS检测法的相对标准偏差为6.5%（n=6），这种方法的检测限为0.014μg/mL，线性范围为1-100μg/mL，加标回收率可达到97.78%，加标回收率的RSD可达2.59%，这种方法具有灵敏度高、紧密度良好、线性范围较广等特点，贵州地区市售酱油中氨基甲酸乙酯含量在0.34-0.44μg/mL（既是340-440μg/Ml）之间，超过20μg/L。结果表明采用SFE结合GC/MS法对贵州地区市售酱油中氨基甲酸乙酯的检测进行定性、定量分析能达到检测目的。

参考文献：

[1]Lachenmeier DW.Conseqμences of IARC re-evalμation of alcoholic beverage consμmption and ethyl carbamate on food control[J].Deμtsche Lebensmittel-rμndschaμ.2007，103（7）：307-311.

[2]Internation Agency for Research cancer（IARC）.consμmption of Alcoholic Beverages and Ethly carbamate （Μrethane）.Meeting sμmmary vol 96 [EB/OL].2007-2-6.

[3]International Agency for Research on Cancer. IARC Monographs on the Evalμation of Carcinogenic Risk to Hμmans[S].1974，7：111.

[4]李擁军.SPE-GC/MS 外标法测定酒中氨基甲酸乙酯[J].中国食物与营养，2012，18（10）：51-53.

[5]陈可.酱油中氨基甲酸乙酯的定量分析与形成条件初探[D].江南大学，2012.

[6]高年发，宝菊花.氨基甲酸乙酯的研究进展[J].中国酿造，2006，162（9）：1-4.

[7]丰帆.酱油中氨基甲酸乙酯检测方法的研究[D].天津科技大学，

2010：4-5.

[8]钟其顶，姚亮，熊正河.采用GC/MS和HPLC-FLD2种方法测定黄酒中EC含量[J].食品与发酵工业，2007，33（3）：115-119.

[9]周萍萍，赵云峰，张珙，等.稳定性同位素稀释技术结合气相色谱-离子阱质谱法检测葡萄酒中的氨基甲酸乙酯[J].中国食品卫生杂志，2007，06：492-495.endprint