帕立骨化醇对糖尿病肾病大鼠尿液Podocalyxin水平的影响

兰凯+张光伟+秦迎霞+倪菁

摘要：目的 探讨帕立骨化醇对糖尿病肾病（DN）大鼠尿液足细胞表面标志蛋白Podocalyxin（PCX）的影响。方法 采用链尿佐菌素（STZ）腹腔注射的方法构建DN大鼠动物模型，将造模成功的大鼠随机分为帕立骨化醇组（P组）、DN组（D组），并设置健康对照组（N组）。P组大鼠每周灌胃帕立骨化醇3次，每次剂量0.4 μg/kg，给药12 w后检测各组大鼠尿液PCX水平、24 h尿蛋白定量及一般生化指标。结果 与N组相比，D组和P组PCX水平和24 h尿蛋白定量明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；P组显著低于D组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 帕立骨化醇可以通过减轻肾小球PCX蛋白的损伤，从而改善糖尿病肾病大鼠蛋白尿的产生。

关键词：糖尿病肾病；帕立骨化醇；PCX

中图分类号：R587.2 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）21-0028-03

Effects of Paricalcitol on Urine Podocalyxin Levels in Diabetic Nephropathy Rats

LAN Kai，ZHANG Guang-wei，QIN Ying-xia，NI Jing

（School of Clinical Medicine，Xi'an Medical University，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of paclitaxel on the expression of Podocalyxin（PCX）in the urine podocyte of diabetic nephropathy（DN） rats.Methods Using streptozotocin（STZ）intraperitoneal injection method to construct DN rat animal model，the successful model of the rats were randomly divided into paricalcitol group（P group），DN group（D group），and set up a healthy control group（N group）.P rats by gavage every week paricalcitol 3 times per dose 0.4 μg/kg，urine PCX levels of rats in each group after treatment for 12 w，24 h urinary protein and biochemical indices. Results Compared with N group，D group and PCX P group and 24 h urinary protein was significantly increased，the differences were statistically significant（P<0.05）；P group was significantly lower than that in D group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion Paricalcitol can reduce glomerular PCX protein damage，thereby improving proteinuria in diabetic nephropathy rats.

Key words：Diabetic nephropathy；Paricalcitol；PCX

糖尿病腎病（diabeticnephropathy）是糖尿病的主要慢性微血管并发症之一，是目前引起慢性肾功能衰竭的主要原因。在西方国家，糖尿病肾病是终末期肾病的首要原因，在我国糖尿病肾病虽然在终末期肾病各种病因中的发生率还居原发性肾小球肾炎之后，但随着人们生活质量的改善有逐年递增的趋势。糖尿病肾病一旦发展到终末期肾病必须依靠替代治疗来维持，因此早期治疗非常重要。近年来研究发现肾小球足细胞损伤和脱落在糖尿病肾病肾小球滤过屏障通透性的改变及蛋白尿的发生发展中起关键作用。PCX是肾小球足细胞足突顶端膜区的主要跨膜蛋白之一，参与维持肾小球滤过屏障正常结构。近年来有研究发现活性维生素D类似物帕立骨化醇具有减少糖尿病肾病大鼠尿蛋白及肾脏保护作用[1-2]，但具体作用机制尚不清楚，可能与改善肾小球滤过屏障结构有关，目前这方面的研究较少。本研究拟通过帕立骨化醇对糖尿病肾病大鼠尿蛋白和PCX水平的影响，探讨其对肾脏保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1动物模型的建立与分组

清洁级封闭群雄性SD大鼠30只，体质量（210±20）g。20只大鼠造模，10只为健康对照组（N组）。大鼠造模后禁食10 h，单次无菌腹腔注射65 mg/kg链脲菌素（购于美国Sigma公司）。72 h后取尾静脉血测空腹血糖（FBG），FBG≥16.65 mmol/L确定为糖尿病大鼠，3 w后24 h尿蛋白量≥30 mg确认糖尿病肾病大鼠模型制备成功；健康对照组注射等量的柠檬酸缓冲液。造模成功的糖尿病肾病大鼠随机分成：帕立骨化醇治疗组（P组，10只），将帕立骨化醇溶于丙二醇中，以0.4 μg/kg的剂量3次/w灌胃；糖尿病肾病组（D组，10只）。D组与N组给予等量丙二醇灌胃，连续12 w。12 w后收集24 h尿，心脏取血4～5 ml。

1.2一般指标检测

苄乙氯铵沉淀法检测24 h尿蛋白。自动生化仪检测空腹血糖（FBG）、血肌酐（Scr）、血钙、血磷和甲状旁腺激素（PTH）。endprint

1.3尿液PCX测定

根据试剂盒操作流程，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定尿液PCX水平。

1.4统计学处理

采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。计量资料数据用（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t檢验。

2结果

2.1治疗12 w后各组大鼠指标变化

P、D组24 h尿蛋白量、空腹血糖、肌酐和PTH均高于N组，差异均有统计学意义（P<0.05）；P组24 h尿蛋白量、肌酐显著低于D组，差异有统计学意义（P<0.05）；P组血钙、血磷与N组差异无统计学意义，见表1。

2.2治疗12 w后各组大鼠尿液PCX水平变化

P组和D组PCX水平高于N组（P<0.05）；P组PCX水平低于D组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

3 讨论

在西方国家，糖尿病肾病是终末期肾病的首要原因，在我国糖尿病肾病虽然在终末期肾病各种病因中的发生率还居原发性肾小球肾炎之后，但随着人们生活方式的改变有逐年递增的趋势。糖尿病肾病是糖尿病最常见并发症，一旦发展到终末期肾病必须依靠肾脏替代治疗，因此早期干预非常重要。糖尿病肾病表现为肾小球内高灌注、高滤过、高压力，进而出现肾小球毛细血管袢基底膜增厚和基质增生。由于糖尿病肾病患者机体存在极其复杂的代谢紊乱，一旦发展到终末期肾病，往往比其它肾脏疾病治疗更加棘手。因此在糖尿病肾病早期进行积极有效地干预治疗，已成为当前糖尿病和肾脏病学界十分热点的课题。研究发现糖代谢异常、肾脏血流动力学改变、氧化应激等因素，可引起肾小球滤过屏障的损伤，导致蛋白尿的发生，而微量蛋白尿是糖尿病肾病的早期标志[3-4]。由于肾小球滤过膜因炎症、免疫、代谢等因素损伤后滤过膜孔径增大、断裂和静电屏障作用减弱，血浆蛋白质特别是清蛋白滤出，超出近端肾小管重吸收能力而形成的蛋白尿。临床上见到持续性蛋白尿往往意味着肾脏的实质性损害。当蛋白尿由多变少时，既可反映肾脏病变有所改善，也可能是由于大部分肾小球纤维化，滤过的蛋白质减少，肾功能日趋恶化，病情加重的表现。蛋白尿已被证实是肾脏损害的独立危险因素，有效减少蛋白尿可以延缓糖尿病肾病肾脏功能减退。

近来研究发现活性维生素D具有广泛的生理功能，除调节体内钙磷代谢外，还影响免疫、神经、生殖、内分泌、上皮及毛发生长等生理活动的调节。活性维生素D是一种前类固醇激素，它通过细胞内特异的维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）介导发挥其生物学活性。VDR分为两大类：膜受体（membrance VDR）和核受体（nuclear VDR）。膜受体主要参与维持钙磷代谢平衡，核受体则主要影响基因转录，以及靶蛋白合成的调节。未结合维生素D的VDR既存在于胞浆也存在于细胞核内；而与维生素D结合后的VDR即以二聚体形式转位到细胞核内，作为转录因子与存在于靶基因启动子区域的维生素D反应元件相作用，调控靶蛋白基因的转录。维生素D类似物的分子结构同维生素D相似，可以和VDR结合，具有与活性维生素D3相似的生物学活性。目前主要包括骨化三醇（Calcitriol， 1，25-Dihydroxycholecalciferol）、帕立骨化醇（Paricalcitol，19-nor-1，25-dihydroxyvitamin D2）和度骨化醇（doxercalciferol，1-alpha-hydroxyergocalciferol）。维生素D类似物通过结构修饰改变产生生物学效应。维生素D类似物的分子结构同维生素D相似，可以和VDR结合，具有与活性维生素D相似的生物学活性。帕立骨化醇作为维生素D类似物的一种，目前对其的研究主要集中在调节钙磷代谢及预防佝偻病等方面的作用，近年来有关帕立骨化醇可能参与肾脏保护作用的研究越来越多。研究发现帕立骨化醇不仅具有调节钙磷代谢的生物学作用，还可通过抑制RAS系统、炎症因子分泌、细胞外基质沉积、系膜细胞增殖等途径改善糖尿病肾病病理生理过程，具有独立于钙磷代谢以外的肾脏保护作用[5-6]。研究发现糖尿病肾病时活性维生素D水平与血浆肾素活性和血管紧张素Ⅱ呈负相关。研究表明帕立骨化醇可以使糖尿病肾病大鼠肾小管上皮间充质转化及小管间质改变减轻，同时伴有肾保护作用，并且未发生高钙血症等问题[7-8]。帕立骨化醇可以通过抑制肾素合成基因表达的环腺苷酸信号通路，阻断部分环腺苷酸与环腺苷酸反应原件结合区对肾素基因启动子的活化，可以抑制肾素基因转录启动，从而减少肾素的合成[9-11]，从而有效改善肾脏内环境，扩张肾动脉，降低肾小球内压，改善血流动力学，起到肾脏保护作用。帕立骨化醇能通过抑制循环及肾脏局部组织肾素-血管紧张素系统活性而对肾脏具有保护作用，其保护作用不依赖于细胞外钙磷水平的变化，在本研究中也得到证实。有研究观察缺失VDR突变型糖尿病小鼠生长发育，发现此类小鼠体内存在强大肾素-血管紧张素系统激活作用，同时伴有严重肾损伤，而通过给予维生素D类似物治疗，明显改善肾损伤。研究发现肾脏部分切除的小鼠给予补充活性维生素D类似物可使足细胞损伤减少，通过降低足细胞蛋白丢失和消除足细胞过度肥大，从而减少蛋白尿及肾小球硬化。这种保护不依赖于肾小球滤过率或血压等因素改变，也不是血液动力学机制可以解释的，可能是通过足细胞修复或者肾小管间质损伤的修复而实现。

足细胞是肾小囊脏层上皮细胞，它附着于肾小球基底膜的外侧，连同肾小球基底膜和毛细血管内皮一起构成肾小球血液滤过屏障，是各种肾小球炎症及非炎症损伤的靶位。足细胞的损伤在糖尿病肾病的发生发展中起了重要作用，足细胞结构和功能蛋白逐渐被人们所认识，其中PCX作为足细胞上表达的一种标志性蛋白，通过离子交换调控因子复合物对足细胞结构形成和维持起重要作用，同时也是肾小球主要带负电荷的蛋白分子，参与形成肾小球电荷屏障[12-13]。PCX是CD34相关性唾液黏蛋白，由肾小球内皮细胞和足细胞合成，在足细胞成熟过程中固定于足细胞顶膜。PCX是肾小球足细胞足突顶端膜区的主要跨膜蛋白之一，参与维持肾小球滤过屏障正常结构。正常肾小球通过分子屏障和电荷屏障几乎可以完全阻止血浆清蛋白分子的滤过，而足细胞PCX表达的减少将直接导致肾小球电荷屏障的阴离子分布减少，使得清蛋白更容易滤过；同时，PCX的减少也影响足细胞裂隙隔膜正常结果的维持。研究发现，多种肾脏疾病在发生肾损伤时，尿液中都可以检测到PCX水平增加，同时伴随肾小球基底膜的损伤，足细胞顶膜区的PCX表达也增加。研究证实肾脏损伤后，尿液中增加的PCX来源于足细胞顶膜区，而非脱落的足细胞碎片，表明尿液中PCX水平增加在肾脏损伤早期，早于足细胞从基底膜脱落以及足细胞损伤后活化的细胞膜脱落。研究发现，糖尿病肾病病人尿液中检测到的PCX水平增加，并且伴有肾小球基底膜的损伤，足细胞顶膜区的PCX表达相应增加，同时PCX减少会影响足细胞裂孔膜正常结构维持，与糖尿病肾病蛋白尿的产生关系密切[14-15]。本研究发现在帕立骨化醇治疗12 w后糖尿病肾病大鼠蛋白尿指标较未治疗组明显下降，肌酐水平也有下降，尿液中的PCX蛋白水平较未治疗组有所下降，证实了其具有独立于钙磷代谢以外的肾脏保护作用，我们推测帕立骨化醇可能具有修复足细胞PCX蛋白损伤的作用，其作用途径有待于经一步研究。endprint

综上所述，糖尿病肾病大鼠会出现蛋白尿，蛋白尿是引起肾功能减退的重要原因，帕立骨化醇可以减轻肾小球PCX蛋白的损伤，从而改善糖尿病肾病大鼠蛋白尿的，改善肾脏功能，延缓糖尿病肾病的发展，给临床上糖尿病肾病的治疗提供了新思路。

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編辑/李桦endprint