鲤鱼源嗜水气单胞菌FAH5分离鉴定及其对寄主感染的解剖病理学研究

余文杰，陈观水

(1.漳州职业技术学院，食品与生物工程系，福建 漳州 363000；2.福建农林大学，生命科学学院，福建 福州 350001)

鲤鱼源嗜水气单胞菌FAH5分离鉴定及其对寄主感染的解剖病理学研究

余文杰1，陈观水2*

(1.漳州职业技术学院，食品与生物工程系，福建 漳州 363000；2.福建农林大学，生命科学学院，福建 福州 350001)

【目的】对具有典型溶血性病征的染病鲤鱼进行病原菌分离纯化鉴定，并研究其对寄主感染的解剖病理学特征。【方法】采用营养琼脂平板划线方法从染病鲤鱼肝脏样本中分离得到病原菌菌株FAH5，使用VITEK-32全自动细菌分析仪进行其生理生化特性探讨，初步鉴定为嗜水气单胞菌。然后，采用嗜水气单胞菌FAH5人工感染健康鲤鱼，并通过解剖分析其器官病变情况。【结果】感染嗜水气单胞菌FAH5后，鲤鱼体表粘液增加，分泌物增多，鳍部和腹部泛红，鳃部出现腐烂现象，并充血发黑。解剖后腹腔和内脏有出血点，肝脏，肾脏，脾脏等器官病理变化以血液循环障碍，血管扩张为主，严重感染时这些器官有充血、出血和溶血现象，活性细胞经感染病变至弥散性坏死。【结论】有溶血性病征的染病鲤鱼分离纯化得到了嗜水气单胞菌FAH5，人工感染健康鲤鱼后出现相同症状，解剖病理学特征为腹腔和内脏有出血点，肝脏，肾脏，脾脏等器官病变以血液循环障碍，血管扩张为主。

鲤鱼；嗜水气单胞菌；分离鉴定；解剖病理

【研究意义】鲤鱼是亚洲原产的温带淡水鱼，喜欢生活在平原地区气候温暖的湖泊，并且喜欢生活在水流缓慢的河川里。很早以前中国和日本就把鲤鱼当做观赏鱼或食用鱼养殖，而在德国等欧洲国家主要作为食用鱼被养殖[1]。鲤鱼背鳍比较长，没有脂鳍，通常口边有须，一般为2根，但也有的没有须。鲤鱼肉质鲜白，营养价值很高，其中的鱼籽加工成的鱼籽酱产品营养丰富，经济价值很高。【前人研究进展】中国地区的鲤鱼产业养殖在20世纪80年代中后期不断发展，随后不断壮大[2]。鲤鱼生长适应力强，生长迅速，遗传稳定，饲料品质丰富，产量高。近些年，养殖规模扩大和养殖数量提高以后，养殖户忽视了疾病预防措施，导致鲤鱼的疾病品种增加，特别是一些机会污染菌引发的疾病[3]。鲤鱼疾病的深入研究现如今处于起始阶段，大部分研究人员局限在鲤鱼疾病的分类和防治方法的简单探讨上面[4-5]，鲤鱼病原菌的研究主要集中在嗜水气单胞菌、链球菌和乳球菌分类上面[6-8]，很少涉及到致病性因子和致病机理的研究。迄今为止，鲤鱼受到嗜水气单胞菌感染后的解剖病理学研究还没有研究人员涉及。2015年7月份，福建省闽侯县泰富鲤鱼养殖场的鲤鱼爆发群体性疾病，死亡率达到80 %以上，造成养殖户经济损失严重。【本研究切入点】本研究拟对染病鲤鱼进行病原菌分离纯化和鉴定，并且开展此病原菌人工感染健康鲤鱼的解剖病理学观察。【拟解决的关键问题】旨在探讨该病原菌的致病机制和有效预防控制措施，为鲤鱼养殖产业的发展提供理论研究基础。

1 材料与方法

1.1 染病鲤鱼收集与病原菌的分离纯化

养殖场的染病鲤鱼经观察患典型败血症，其主要症状为反应迟钝，不摄食，严重者口鼻充血、出血。冷藏样本带回实验室解剖后，观察可见其肝脏肿大，有点状出血，肾脏、肠道充血。在无菌条件下从染病鲤鱼的肝、肾，皮肤和血液取样，营养琼脂平板划线分离，30 ℃培养24 h，挑取单菌落纯化培养，经分离纯化后的菌株低温保存备用。

1.2 细菌鉴定

经细菌形状、革兰氏染色和生理生化检测，采用法国梅里埃生物公司革兰氏阴性或阳性细菌鉴定试剂条进行检测，而后使用VITEK-32 全自动细菌分析仪进行鉴定。

1.3 试验用健康鲤鱼

人工感染所使用的健康鲤鱼体长为6～8 cm，体重量为25～35 g，购买自福建省农科院鲤鱼养殖场，在实验室养殖温室正常饲养7 d后用于人工感染病原菌试验。

1.4 试验方法

1.4.1 人工感染病原菌试验 设定嗜水气单胞菌FAH5感染组和生理盐水注射对照组，每组鲤鱼30尾。将前述分离纯化的嗜水气单胞菌FAH5在营养琼脂上30 ℃培养18 h,然后以无菌生理盐水稀释成8×106cells/mL的菌液。感染组的鲤鱼腹腔使用一次性针筒注射菌液，剂量150 μl/尾，对照组注射150 μl/尾的无菌生理盐水。鲤鱼饲养池水温为25 ℃，24 h持续充气，每天换水1次，换水量约为1/3。试验以14 d为1个周期，每天记录鲤鱼的发病以及死亡情况，并且固定典型特征死亡鲤鱼，用于后续解剖病理学分析。

1.4.2 解剖病理切片的制备 分别收集5尾人工感染组鲤鱼和3尾对照组鲤鱼的肝脏、脾脏、肾脏，解剖后使用波恩氏液和体积分数为2.5 % 的戊二醛进行固定。固定后的解剖块使用梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，最后使用莱克2180切片机进行切片，切片厚度为5 μm。切片完成后使用苏木精-伊红染色，中性树胶封片，使用奥林帕斯显微镜进行病理图像拍照分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌生理生化反应及其鉴定

病原菌菌株FAH5经分离纯化后，使用VITEK-32 全自动细菌分析仪鉴定为嗜水气单胞菌，生理生化特性具体见表1。

2.2 鲤鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后临床学特性研究

从图1可以看出，健康鲤鱼体表和解剖后内脏均无典型病症。鲤鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后，其体表出现粘液增加的现象，可见斑状血点，鳍部和腹部泛红; 鳃部出现腐烂充血发黑(图2～3)。解剖后腹腔和内脏器官有出血点，肝脏，肾脏，脾脏等器官病理变化以血液循环障碍，血管扩张为主，严重感染时这些器官有充血、出血和溶血现象(图4～5)。鲤鱼人工感染嗜水气单胞菌FAH5试验结果表明，感染初期, 鲤鱼就开始出现疾病和出现死亡现象，7 d后死亡率高达70 %，相比较，对照组在实验期内均未出现死亡，也无典型病征(表2)。

2.3 解剖病理学研究

2.3.1 人工感染嗜水气单胞菌FAH5鲤鱼肝脏发病情况 鲤鱼感染病原菌程度轻度时，肝脏病理变化主要出现血液循环降低，肝脏中央静脉扩张，引发红细胞肿胀，严重感染时肝脏血管内皮细胞肿胀，导致血管腔溶血，肝脏血管周围引发出血，引起含铁血红素沉积。早期病变肝脏细胞界限比较清楚，细胞稍微肿胀，胞质中出现少量空泡，这些空泡随后逐渐合并后出现明显的变性空泡。随着病情加重，肝脏细胞出现弥散性坏死灶。大部分坏死肝脏细胞中心核消失，或者出现核固缩和核碎裂。伴随血红细胞的溶血，肝脏细胞出现贫血现象。肝脏细胞被膜透明变性，导致细胞死亡(图6)。

2.3.2 人工感染嗜水气单胞菌FAH5鲤鱼脾脏发病情况 鲤鱼感染病原菌程度轻度时，脾脏病理变化主要是可以明显区别脾脏红白髓细胞，其中含有丰富的淋巴细胞。脾腔中红细胞数量少，血液循环较为顺畅。脾脏周围观察到红细胞肿胀现象，其红细胞胞质内含少量粉红色细颗粒，脾窦稍微扩张，动脉和静脉血管中红细胞开始肿胀。随着病情加重，脾脏细胞内贫血，血管中红细胞出现溶血，在毛细管血管周围出现红细胞坏死。坏死细胞其核内结构慢慢消失，导致细胞核消失，或者核碎裂和核固缩(图7)。

表1 菌株FAH5生理生化特性

图1 鲤鱼未感染嗜水气单胞菌FAH5解剖切片对照Fig.1 Anatomical slice of carp without infection of Aeromonas hydrophila FAH5

图2 鲤鱼感染嗜水气单胞菌FAH5体表皮肤出血Fig.2 Skin hemorrhage of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

实验组类别Experimentalgroupcategory实验鲤鱼数量Experimentalcarpnumber人工感染后不同时间段鲤鱼死亡数量Mortalityofcarpatdifferenttimeafterartificialinfection1d2d3d4d5d6d7d8d9d死亡鲤鱼数量NumberofdeadcarpFAH5感染组3034552110021生理盐水对照组300000000000

图3 鲤鱼感染嗜水气单胞菌FAH5体表尾鳍出血Fig.3 Tail fin bleeding of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

图4 鲤鱼感染嗜水气单胞菌FAH5解剖切片肝脏出血Fig.4 Hepatic hemorrhage of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

图5 鲤鱼感染嗜水气单胞菌FAH5解剖切片肠道出血Fig.5 Intestinal bleeding of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5

2.3.3 人工感染嗜水气单胞菌FAH5鲤鱼肾脏发病情况 鲤鱼感染嗜水气单胞菌FAH5后其肾脏的病变主要是肾间质出现肿胀和充血现象，淋巴细胞出现坏死现象，肾脏细胞出现贫血现象；肾小体和肾小管影响程度较小，肾小管出现少量颗粒沉淀，从而丧失排水能力；肾小体毛细血管出现萎缩现象，导致肾脏细胞囊腔变大(图8)。

图6 鲤鱼感染嗜水气单胞菌FAH5肝脏器官切片(400倍)Fig.6 Liver organ slice of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5 (400×)

图7 鲤鱼感染嗜水气单胞菌FAH5脾脏器官切片(500倍)Fig.7 Splenic biopsy of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5 (500×)

图8 鲤鱼感染嗜水气单胞菌FAH5肾脏器官切片(400倍)Fig.8 Renal biopsy of carp infected with Aeromonas hydrophila FAH5 (400×)

3 讨 论

采用营养琼脂平板划线方法从染病鲤鱼肝脏样本中分离得到病原菌菌株FAH5，使用VITEK-32全自动细菌分析仪进行其生理生化特性探讨，初步鉴定为嗜水气单胞菌。这和前人的研究比较相似，如嗜水气单胞菌感染鲤鱼后产生败血症和出血性水肿，气单胞菌感染鲤鱼产生腹水疾病[4-5]。储卫华等从患病鲤鱼中可以分离到病原菌嗜水气单胞菌和温和气单胞菌[7]。

将分离纯化的嗜水气单胞菌FAH5人工感染健康鲤鱼后，感染组和自然发病鱼体症状一致，因此认为自然发病鱼体的病原菌为嗜水气单胞菌。鲤鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后的临床症状表现为，体表粘液出现增加，分泌物增多，以典型败血症为特征，鳍部和腹部泛红，鳃部出现腐烂，充血发黑。解剖后腹腔和内脏器官有出血点，肝脏，肾脏，脾脏等器官病理变化以血液循环障碍，血管扩张为主，严重感染时这些器官有充血、出血和溶血现象，活性细胞经感染病变至弥散性坏死。

染病鲤鱼解剖病理研究发现，嗜水气单胞菌产生的毒素是通过血液循环作用进入到各内脏器官，从而损伤各个内脏器官的功能。肝脏，脾脏，肾脏的病理变化是从血管及血红细胞产生病变，然后引发各个内脏器官充血、出血和溶血。内脏器官解剖切片研究表明，鲤鱼的肝脏，脾脏和肾脏在发病初期，均表现为局部血液循环障碍，微血管肿胀扩张，引发脏器充血、出血、溶血和贫血现象，最后引发活性细胞颗粒变性和空泡变性，再发展后出现弥散性坏死灶。引发鲤鱼产生这些病变的原因主要是致病性嗜水气单胞菌分泌各种毒素，包括溶血素、肠毒素和细胞毒素，这些毒素引发血红细胞裂解，活性细胞渗透性变大，损伤毛细血管，引起鲤鱼败血症[9-10]。本研究的结果表明，对于鲤鱼的养殖，在疾病产生初期，内脏器官还未出现实质病变的时候，采取预防措施可以使鲤鱼恢复健康，但如果疾病严重并且爆发时间较长时，就会出现鲤鱼器官坏死，无法进行治疗。

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DetectionofAeromonashydrophilaFAH5andPathologicalObservationofCyprinuscarpioInfectedwithStrain

YU Wen-jie1, CHEN Guan-shui2*

(1.Zhangzhou Vocational and Technical College, Department of Food and Biological Engineering, Fujian Zhangzhou 363000,China；2.Fujian Agriculture and Forestry University, College of Life Sciences, Fujian Fuzhou 350001,China)

【Objective】The pathogenic bacteria were isolated, purified and identified from the infectedCyprinuscarpiowith typical hemolytic symptoms, and the anatomical and pathological features of the infection were studied.【Method】The pathogen FAH5 was isolated from infectedCyprinuscarpioliver samples, its physiological and biochemical characteristics by VITEK-32 automatic analyzer were studied, which was identified asAeromonashydrophila. Then, the healthyCyprinuscarpiowere infected withAeromonashydrophilaFAH5, and their anatomical pathological changes were analyzed.【Result】After the infection withAeromonashydrophilaFAH5,Cyprinuscarpiomucus increased, secretions increased, fins and abdomen became red, and gills appeared rotten.The anatomy of abdominal and visceral organ was found bleeding, and the blood circulation disorders and vascular dilatation of the liver, kidney, spleen and other organs were found.Serious infections in these organs were found with hyperemia, hemorrhage and hemolysis.【Conclusion】TheAeromonashydrophilaFAH5 was isolated from theCyprinuscarpiowith hemolytic disease symptoms. The anatomy of abdominal and visceral organ was found bleeding, and the liver, kidney, spleen and other organs were found blood circulation disorders and vascular dilatation. Serious infection in these organs was found with hyperemia, hemorrhage and hemolysis.

Cyprinuscarpio;Aeromonashydrophila; Detection; Anatomical pathology

1001-4829(2017)10-2388-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.038

2016-11-10

国家自然科学基金(30900915)；福建省科技厅科学研究项目(JK2012012)

余文杰(1977-)，男，福建漳州人，讲师，硕士，从事生物科学的教学及科研工作，E-mail：1527076860@qq.com；*为通讯作者：陈观水，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：主要从事基因克隆与功能相关研究工作，水产动物繁育及病害防治，E-mail：2085404947@qq.com。

S965.116

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(责任编辑 陈 虹)