蓝莓帚梗柱孢枝枯病病原菌鉴定及生物学特性

费诺亚，李 媛，石凌波，孟婷婷，傅俊范，严雪瑞

(沈阳农业大学植物保护学院，辽宁 沈阳 110866)

蓝莓帚梗柱孢枝枯病病原菌鉴定及生物学特性

费诺亚，李 媛，石凌波，孟婷婷，傅俊范，严雪瑞*

(沈阳农业大学植物保护学院，辽宁 沈阳 110866)

【目的】2015年6月在来自湖北随州的蓝莓苗木中，发现一种由帚梗柱孢霉引起的枝枯病。本研究开展了致病菌的鉴定工作，为病害的防治提供指导。【方法】病样分离物通过组织分离、单孢分离及纯化后，用柯赫氏法则进行了致病性测定。致病菌的鉴定采用形态学、ITS序列比对及基于EF-1α，β-tubulin和Histone 3三段基因的系统发育树的联合确定，同时本研究对病原菌的生物学特性进行了测定。【结果】通过分离及致病菌测定后，选取代表菌株HBSZ05Ba进一步研究。形态学特征及ITS比对结果均将代表菌株划分入帚梗柱孢霉属球状囊泡组，三段基因联合系统发育树结果表明，该病害的病原菌为Cylindrocladiumcanadense(有性态为Calonectriacanadensis)。生物学特性试验结果表明：菌丝生长最适温度为25 ℃，最适培养基为PDA，光照对菌落生长无明显影响，最适氮源为NaNO3，最适碳源为可溶性淀粉。【结论】湖北随州蓝莓枝枯病病原菌经鉴定为C．canadense，该种真菌在蓝莓上的为害属首次报道。

蓝莓；枝枯病；鉴定；生物学特性

【研究意义】蓝莓 (英文Blueberry)，世界范围的一种新兴小浆果树种，指原产北美地区的杜鹃花科 (Ericaceae) 越橘属 (Vaccinium) 中蓝果类型植物。根据吴林研究显示[1]，至2015年在全国超过20个省市区开展了蓝莓种植，总面积约3×108m2，产量达2.5×107kg。随着种植面积与产量的逐年上升，病害的种类也逐年增大，尤其是枝枯类病害对蓝莓品质造成的影响不容忽视。【前人研究进展】丽赤壳属真菌(Calonectria) 和其无性态帚梗柱孢霉属 (Cylindrocladium) 是在全世界范围广泛分布的重要植物病原真菌，尤其是在亚热带和热带地区，寄主范围广，存在于土壤或植物病残体中，引起多种植物病害，如根腐病、猝倒病等[2]。【本研究切入点】2015年在一批来自湖北随州的蓝莓苗木中，在品种‘埃利奥特’的植株上，发现一种帚梗柱孢霉引起的枝枯病，其症状是茎部出现表皮干枯，并伴有开裂，干枯部可环绕枝条。【拟解决的关键问题】为鉴定该病害的病原，本文对病原菌进行了分离纯化与鉴定，并对该病原菌生物学进行了研究。

1 材料与方法

1.1 病原菌分离纯化

分离：采用常规的组织分离法[3]，取具有典型症状病害样品的病健交界处切块并进行表面消毒后置于PDA平板 (d=90 mm) ，25 ℃条件下培养，观察菌落形态，统计分离频率。

纯化：将分离得到的菌株转至SNA培养基25 ℃培养[4]，产孢后进行单孢分离纯化，以无菌水洗脱分生孢子制成悬浮液。吸取孢悬液0.1 mL至4 % WA平板上，使用灭菌的L型涂布器将孢悬液均匀涂布于平板表面，静置10 min。将WA平板切成0.4 cm×0.4 cm的小块，逐个镜检，选择载有单个孢子的琼脂块移至PDA上培养。

保存：将纯化后的菌株转至PDA斜面上，4 ℃保存。

1.2 病原菌致病性测定

采用活体伤口接种法，挑选健康的两年生‘埃利奥特’品种蓝莓植株，无菌水洗净并用酒精棉消毒后，用灭菌刀片在植株枝条上造成轻微伤口，将供试菌株HBSZ05Ba在PDA上活化3 d后，使用灭菌打孔器于菌落边缘处打取菌饼 (d=5 mm) 贴在灭菌脱脂棉上，将脱脂棉分别贴靠在枝条的伤口上，使菌丝与伤口充分接触，缠绕保鲜膜固定保湿，3次重复，对照试验中将菌饼替换为无菌PDA块。25 ℃条件下48 h后摘掉脱脂棉并观察发病情况，持续喷水保湿，5 d后再次观察结果并记录。

1.3 病原菌的鉴定

1.3.1 形态学鉴定 参照Crous[5]的研究，对病原菌的形态学进行鉴定，观察在25 ℃、SNA培养基上培养10 d时的分生孢子形态与囊泡形状等。

1.3.2 分子生物学鉴定 病原菌DNA提取：供试菌株活化培养3 d后，打菌饼 (d=5 mm) 接种到PD液体培养基中，室温条件下使用回旋振荡器 (130 r/min) 培养5 d后收集菌丝，菌丝体冷冻干燥备用。基因组DNA提取采用CTAB法，并置于-20 ℃冰箱中保存待用。

ITS序列扩增及比对：使用引物序列见表1。PCR扩增产物经凝胶电泳检测后送上海生工生物工程有限公司进行测序，结果在Genbank数据库进行BLAST比对分析。

EF-1α，β-tubulin及Histone 3扩增与系统发育分析：引物序列见表1。挑选出与目标菌株序列相近的已知种及帚梗柱孢霉属球形囊泡组的模式菌株序列进行系统发育分析，参考菌株相关信息见表2。用软件ClustalX2.1对所有序列进行对位排列 (alignment)；使用软件MEGA7对EF1-α，β-tubulin及Histone 3[6]联合基因采用最大似然法 (ML) 构建系统发育树，以C．colhounii作为外群。

1.4 病原菌生物学特性

对病原菌在不同条件下的菌丝生长情况进行测定，以全光照、全黑暗、12 h光暗交替作为不同光照条件；不同温度条件选择5、10、15、20、25、30、35 ℃。将病原菌接种在PDA上，并于不同光照、温度条件下培养。以查氏培养基作为不同碳源与氮源的基础培养基，不同碳源选择与查氏中蔗糖等量的葡萄糖、麦芽糖、可溶性淀粉、乳糖；不同氮源选择与查氏中NaNO3等量的半胱氨酸、甘氨酸、NH4H2PO4、(NH4)2SO4。将活化3 d的病原菌接种至上述不同氮源、碳源培养基，25 ℃恒温培养条件。上述每个处理重复3次，分别在3，5，7 d测量平板上菌落直径。数据通过Excel求取平均值等。

表1 使用引物及序列

表2 构建系统发育树的参考菌株相关信息

2 结果与分析

2.1 病样采集与病原菌分离纯化

帚梗柱孢霉枝枯病的症状是茎部出现表皮干枯，并伴有开裂，干枯部可环绕枝条，后期致整枝枯死，剖开发病茎部可见维管束未受害 (图1，A)。

经组织分离与单孢分离，得到了一株真菌编号为HBSZ05Ba，25 ℃条件下其菌落在PDA培养基上初期菌落白色圆形，边缘整齐，气生菌丝生长旺盛，绒毛状，7 d左右可生长至90 mm (图1，H)，分离频率为75 %。

2.2 病原菌致病性测定

健康的蓝莓植株活体枝条在接种HBSZ05Ba后48 h揭去菌丝块时，即可观察到明显的发病情况，病斑平均长度达1 cm，接种5 d时观察病斑扩展至5 cm，而空白对照组枝条未发病 (图1，B，C，D)。从接种发病的部位可重新分离到与接种菌相同的菌株，而对照组植株不发病，证明所分离接种的菌株为造成蓝莓枝枯病的病原菌。

2.3 病原菌的鉴定

2.3.1 形态学鉴定 分离得到的菌株HBSZ05Ba，分生孢子无色，直圆柱型，两端钝圆，无隔膜或具1个隔膜，分隔处不具明显可见的缢痕 (图1，G)，大小为 (45.0～68.1) × (3.2～5.4) μm，平均62.9 × 4.5 μm。分生孢子梗末端囊泡梨形至球状，直径5～11 μm (图1，E)。在SNA培养基上无超大孢子、小孢子或小型子囊壳形成。PDA培养7 d时菌落开始产生厚垣孢子，呈红褐色 (图1，F)。

2.3.2 分子生物学鉴定 经检测，所提取的DNA浓度为51 ng/μl。将测序得到的菌株ITS，EF1-α，β-tubulin及Histone 3序列提交到NCBI/GenBank获得的基因登录号(ITS-KY984067，EF1-α-KY978481，β-tubulin-KY978482，Histone 3-KY978483)，ITS序列在NCBI中的BLAST结果表明，供试菌株的ITS序列与C.canadensis的同源性达100 %。将供试菌株的EF1-α，β-tubulin及Histone 3基因序列与文献中的模式菌株在NCBI上下载的模式菌株的序列进行联合的系统发育分析，结果与UFV 76以及CBS 110817 (C.canadensis) 聚在同一分支 (图2)。

A．原始发病症状；B．致病性测定5 d时；C．5 d时的对照组；D.接种5 d时的处理组；E．分生孢子梗末端囊泡 (SNA培养基)，标尺=2 μm；F．厚垣孢子 (PDA培养基)，标尺= 20 μm；G．分生孢子形态 (SNA培养基)，标尺=50 μmA．Natural symptoms of stem blight on blueberry；B．Pathogenicity tests after 5 d；C．CK in pathogenicity tests after 5 d；D.Symptoms of inoculated blueberry after 5 d；E．Sphaeropedunculate vesicle，bar=2 μm；F．Chlamydospores on PDA，bar=20 μm；G．Macroconidium on SNA，bar=50 μm图1 HBSZ05Ba所致症状及菌株形态Fig.1 Symptoms on blueberry caused by Cylindrocladium canadense and morphology of the fungal isolate HBSZ05Ba

采取最大似然法 (ML) 基于Kimura 2-parameter模型进行分析，使用软件MEGA7 建立EF-1α，β-tubulin及Histone 3三段基因联合基因系统发育树。以Calonectria colhounii为外群，HBSZ05Ba与 Calonectria canadensis(anamorph Cylindrocladium canadense)聚为一支，Bootstrap值=100%Maximum likelihood method tree based on the Kimura 2-parameter model generated from the combined EF-1α，β-tubulin and Histone 3 genes by MEGA 7．The tree is rooted with Calonectria colhounii，the isolate HBSZ05Ba belongs to Calonectria canadensis(anamorph Cylindrocladium canadense)．Bootstrap values=100%图2 基于EF1-α，β-tubulin及Histone 3三段基因联合系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on combined EF1-α，β-tubulin and Histone 3 gene

2.4 病原菌生物学特性

主要的生物学特性试验结果表明：菌丝生长最适温度为25 ℃不同温度对菌丝生长速率影响明显，5与35 ℃条件下菌丝不能生长 (图1，H)；选取的几种培养基中，在PDA培养基上菌丝生长最快；不同光照条件对菌落生长无明显影响；最适氮源为NaNO3，最适碳源为可溶性淀粉。

3 讨 论

目前国内已报道的蓝莓枝枯病原主要有葡萄座腔菌 (Botryosphaeriadothidea)[9]、小新壳梭孢 (Neofusicoccumparvum)[9]、棒状拟盘多毛孢 (Pestalotiopsisclavispora)[10]、新拟盘多毛孢 (Neopestalotiopsischrysea)[11]、乌饭树拟茎点霉 (Phomopsisvaccinii)[12]、间座壳溃疡病菌 (Diaporthephaseolorum)[13]、尖孢炭疽菌 (Colletotrichumacutatum)[14]、胶孢炭疽菌 (C．Gloeosporioides)[14]，可可毛色二孢 (Lasiodiplodiatheobromae)[9]以及假可可毛色二孢 (L．pseudotheobromae)[15]，且不断有新的蓝莓枝枯病病原被鉴定出来。不同的病原菌在生物学特性方面可能存在差异，因此研究病原的生物学特性十分必要。

根据Crous的研究[5]，帚梗柱孢霉属分类的重要特征是囊泡的形状，然而球形囊泡与梨形或卵圆形易混淆[16]，因此还需进一步的分子生物学鉴定。Lombard等[7]对Calonectria属的多个种进行了ACT，BT，CAL，HIS3，ITS，LSU以及EF-1α共7段基因的多基因联合系统发育分析，将该属分为13个系统发育组 (group)，并根据系统发育结果得出，未知的Calonectria属菌株可通过EF-1α，β-tubulin及Histone 3 3段基因进行鉴定。本次分离到的菌株HBSZ05Ba与曾经在蓝莓上报道的引起叶斑病的柯氏帚梗柱孢[8]在形态学、ITS序列上以及系统发育树中均可以区分。

4 结 论

经形态学与系统发育研究确定引起湖北随州蓝莓枝枯病的病原菌为C．canadense，这是该种真菌为害蓝莓的首次报道，此为区别于的C．colhounii[8]又一帚梗柱孢霉属新种群为害蓝莓的报道。生物学特性试验结果表明，温度与碳源氮源对菌丝生长影响明显，而光照条件无影响。

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IdentificationofCylindrocladiumPathogenofBlueberryStemBlightandBiologicalCharacteristicsTests

FEI Nuo-ya，LI Yuan，SHI Ling-bo，MENG Ting-ting，FU Jun-fan，YAN Xue-rui*

(College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Liaoning Shenyang 110866，China)

【Objective】A new kind of stem blight caused byCylindrocladiumwere found on blueberry from Hubei Suizhou．Several studies were conducted to identify the pathogen and provide theoretical foundation for the disease control．【Method】The pathogen of the disease was isolated and purified and pathogenicity was determined by Kochs postulate．The isolate from blueberry was identified based on morphology, BLAST of ITS and molecular phylogenetic combined TEF-1α，β-tubulin and Histone 3．The biological characteristics were studied．【Result】According to morphology and BLAST of ITS, the represenitive isolate HBSZ05Ba belongs toCylindrocladiumspp．of sphaeropedunculate vesicle. Phylogenetic tree showed that the isolate wasC．canadense(teleomorphCalonectriacanadensis)．The biological tests showed that 25 ℃，PDA was the best colony growth conditions．Different light conditions had no significant effect on the colony growth．The optimum carbon source is soluble starch and the optimum nitrogen source is NaNO3．【Conclusion】The pathogen of stem blight found on blueberry from Hubei Suizhou in June 2015 was identified asC．canadense．It is the first report that this fungus can cause stem blight on blueberry．

Blueberry; Stem blight;Identification; Biological characteristics

1001-4829(2017)10-2251-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.10.016

2017-04-27

公益性行业(农业)科研专项(201103037)；沈阳市科技计划资助项目(F15-167-4-00，F15-079-3-00)

费诺亚(1994-)，硕士，主要研究植物病理学，E-mail：13478871952@163.com，*为通讯作者：严雪瑞，博士，教授，从事园艺植物病理学研究；E-mail：berrypest@126.com。

S435.661

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(责任编辑 李 洁)