烟蚜茧蜂繁蜂棚蚜霉病病原鉴定及防治研究

周挺，陈涛，张瀛，林天然，林勇，林水良，顾钢

1 福建省烟草公司，烟草科学研究所，福建福州北环中路133号 350003；2 福建省三明市烟草公司，烟草科学研究所，福建三明江滨南路166号365000；3 福建省龙岩市烟草公司，烟草科学研究所，福建龙岩龙岩大道288号364000；4 福建省南平市烟草公司，烟草科学研究所，福建南平江滨中路389号353000

烟蚜茧蜂繁蜂棚蚜霉病病原鉴定及防治研究

周挺1，陈涛2，张瀛2，林天然3，林勇4，林水良2，顾钢1

1 福建省烟草公司，烟草科学研究所，福建福州北环中路133号 350003；2 福建省三明市烟草公司，烟草科学研究所，福建三明江滨南路166号365000；3 福建省龙岩市烟草公司，烟草科学研究所，福建龙岩龙岩大道288号364000；4 福建省南平市烟草公司，烟草科学研究所，福建南平江滨中路389号353000

为探明繁蜂棚中蚜霉病的病原种类及防治技术，采集繁蜂棚中感病蚜虫和空气中的真菌，通过显微形态学和转录间隔区（ITS）扩增证实繁蜂棚内寄生蚜虫的病原真菌为蚜虫枝孢霉（Cladosporium aphidis）；密封试验箱内的消毒试验结果表明：在0.5 g/m3和1 g/m3剂量下，三氯异氰尿酸的总杀菌率可达92.31%和92.31%，对蚜虫枝孢霉的杀灭率分别达80.00%和83.33%；二氧化氯的总杀菌率可达97.88%和83.35%，对蚜虫枝孢霉的杀灭率分别达100%和93.33%；利用含三氯异氰尿酸钠的熏蒸剂熏蒸繁蜂棚，对蚜霉病的防治效率达69.65%。

烟蚜茧蜂；大棚；熏蒸；蚜虫枝孢霉；蚜霉病

我国烤烟生产中每年烟蚜危害面积约150000 hm2，造成直接经济损失约7224万元，烟蚜还可传播多种植物病毒，带来更为严重的间接经济损失[1]。利用虫生真菌和天敌昆虫防治蚜虫是重要的生物防治措施，可有效避免化学防治带来的诸多问题。近年来烟草行业在利用烟蚜茧蜂防治烟蚜技术方面取得了长足的进步[2]，并从2014年起在全国烟区大面积推广应用。蚜茧蜂的规模化繁殖是烟蚜茧蜂防治烟蚜的关键环节，由于南方烟区冬、春季白天繁蜂棚内温度10℃～25℃，湿度较大，较适于蚜虫枝孢霉的生长和分生孢子的形成[4-5]，容易造成棚内蚜霉病的发生和流行，成为高效繁蜂的制约因素[3]。通风和喷施杀菌剂可以在一定程度上减少蚜霉病的发生，但棚内空气中的病菌还会继续引起蚜霉病的发生。在封闭空间采用药剂熏蒸措施，可有效杀灭空气中的病原物，具有高效、简便、低残留、低成本的特点。本研究的目的是探明繁蜂棚内蚜霉菌种类，寻找高效、简便、低残留、低成本的蚜霉病防治方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

药剂：97%三氯异氰尿酸（TCCA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；10%二氧化氯（CLO2，山东华实药业有限公司）；“烟雾弹”（三氯异氰尿酸钠烟熏剂，哈尔滨康龙兽药有限公司）。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。

1.2 蚜霉病的病原鉴定

1.2.1 蚜霉病的采集和鉴定

烟蚜茧蜂繁育大棚中采集被病原菌寄生死亡的蚜虫个体，75%酒精中浸泡5 min，无菌水冲洗3遍，置PDA平板上，28℃培养。长出菌落后，转移至新鲜PDA平板，挑取菌落边缘菌丝，置载玻片上制成临时玻片标本，光学显微镜下观察菌丝及分生孢子形态，进行菌株形态学鉴定。

采用CTAB法提取菌体DNA[6]，利用真菌rDNA通用引物 ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 进 行PCR扩增，以无菌水做扩增模板为阴性对照。

PCR产物送英杰生命技术有限公司（Invitrogen）测序，采用计算机分析软件MEGA3.1及NCBI核酸数据库进行拼接和比对分析。

1.2.2 空气中真菌的采集和鉴定

繁蜂棚内制作0.125 m3的密封试验箱，将PDA平板置于密封试验箱内部，10 min后取出，28℃培养48 h后进行形态学鉴定。

1.3 熏蒸效果检验

将灼热的铝盒（Φ=8 cm）置于密封试验箱内部，供试药剂TCCA和CLO2分别设1 g/m3及0.5 g/m32个处理，均匀洒在铝盒上，迅速封闭试验箱，12 h后将PDA平板置于箱内10 min后密封取出，每处理重复3次，以未熏蒸的密封试验箱作为对照。PDA平板28℃培养48 h后计数菌落数并镜检。

1.4 蚜霉病防治试验

选择福建省泰宁县繁蜂基地作为大棚熏蒸试验场地，利用“烟雾弹”于繁蜂后和次年繁蜂前对大棚（33 m×24 m×3 m）各进行1次密闭熏蒸消毒（0.67 g/m3），24 h后通风，随后进行常规繁蜂作业，并记录棚内的温湿度情况。于繁蜂棚外搭建9 m×3 m×2 m的塑料棚作为对照，不进行熏蒸处理，常规繁蜂作业。于蚜虫对数生长期（2月29日接蚜，3月15日调查），利用5点法调查发病蚜虫数，每点调查500头蚜虫，记录被真菌寄生的蚜虫数，计算平均发病率及防治效果。于蚜茧蜂僵蚜大量形成期（3月20日接蜂，4月5日调查），利用5点法调查僵蚜数量，每点调查500头蚜虫，记录僵蚜数量，计算平均僵蚜形成率。

1.5 数据分析

利用SPSSv18.0数据处理软件单因素ANOVA分析各处理之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 蚜霉病的病原鉴定

2.1.1 蚜虫病原菌鉴定

从死亡蚜虫虫体上分离得到的病原菌菌落成深褐色或墨绿色，背面黑色，菌丝具短节状膨大（球状凸起），菌丝顶端着生枝孢，枝孢顶端着生分生孢子（图1），根据菌丝形态学特征，鉴定为蚜虫枝孢霉（Cladosporium aphidis）[7-8]。

图1 蚜虫枝孢霉的菌落（a）和菌丝形态（b，c）Fig.1The colony (a) and mycelium morphology (b,c) of Cladosporium aphidis

利用真菌rDNA通用引物ITS1，ITS4对蚜虫枝孢霉的ITS区进行PCR扩增，得到一条约550 bp的片段（图2），经测序、拼接、比对分析，该序列 与 GENBANK 中 的 KJ361498.1、HQ696055.1、KX078470.1等枝孢属真菌的ITS序列同源性达99%以上，认定该菌属于枝孢霉属。

图2 蚜虫枝孢霉ITS区域PCR扩增Fig.2 The amplicon of ITS region in Cladosporium aphidis isolates

2.1.2 空气中真菌的鉴定

形态学鉴定结果表明，78个菌落中有30株属于蚜虫枝孢霉，与虫体上分离到的病原菌种类一致；48株属于其他类真菌，包括镰刀菌、青霉等植物病原真菌，木霉菌及一些未定种真菌（图3）。

图3 密封试验箱空间捕捉菌落形态鉴定结果Fig.3 Identi fi cation of fungus in hermetic chamber by morphological characters

2.2 密封试验箱熏蒸结果

由表1可知，选用的2种熏蒸剂按照1 g/m3及0.5 g/m3的剂量均可有效杀灭密封试验箱内的各种真菌，各处理总菌落数与对照总菌落数差异极显著，而各处理之间的总菌落数无显著差异。

表1 2种熏蒸剂对密封试验箱的熏蒸效果比较Tab.1 Elimination rate of fungus by fumigating in hermetic chamber

TCCA处理的蚜虫枝孢霉菌落数与对照差异显著， CLO2处理的蚜虫枝孢霉菌落数与对照差异极显著。各处理之间的蚜虫枝孢霉菌落数无显著差异。

试验过程中发现2种熏蒸剂在试验浓度下对烟蚜茧蜂成蜂具有较强毒性。

2.3 蚜霉病防治效果

2016年春季繁蜂期间，繁蜂棚内平均温湿度较适合蚜虫枝孢霉侵染烟蚜[3,5]（表2）。

调查结果显示，经过2次熏蒸后的繁蜂棚内蚜霉病的发生率控制在5%以内（图4），较未熏蒸的繁蜂棚显著降低，防治效果达69.65%；熏蒸过的繁蜂棚较未熏蒸的繁蜂棚僵蚜形成率显著上升，提高14.36个百分点（图5）。

表2 繁蜂棚内不同时期平均温湿度记录Tab.2 Average temperature and humidity in different periods in greenhouse

图4 三氯异氰尿酸熏蒸防治蚜霉病效果Fig.4 Control ef fi cacy of aphid mildew disease by fumigation using TCCA

图5 三氯异氰尿酸熏蒸对烟蚜茧蜂繁殖效率的影响Fig.5 The effect of TCCA fumigation on reproduction of Aphidius gifuensis Ashmaed

3 讨论

蚜虫枝孢霉是一种寄生于蚜虫虫体上的虫生真菌[9-10]，适应温度范围广，对烟蚜具有较强的毒力[4-5]。本研究所采集的真菌样本中有38.46%属于蚜虫枝孢霉，表明蚜虫枝孢霉分生孢子广泛存在于未熏蒸的繁蜂棚空气中，是棚内蚜虫大量病变死亡的直接原因。

在夜间15 ～ 25℃和结露条件下，蚜霉菌较易侵染蚜虫[3]。福建省春季繁蜂棚较易达到此温湿条件，棚内环境不仅适合烟蚜及蚜茧蜂的生长发育，且较易导致蚜霉病的发生流行。本研究是从降低初侵染源的角度出发，相比喷施杀菌剂，熏蒸法可以更彻底地杀灭空间中的病原菌，且不会在烟株叶片上产生雾滴增加环境湿度。

TCCA和CLO2是公认的高效安全广谱消毒剂，广泛应用于食品、医学、农牧业等领域[11-15]，采用熏蒸法消毒温室大棚，药剂的使用剂量低、成本低、操作简便，易于推广。考虑到2种药剂对不锈钢的腐蚀作用，本试验选择了含TCCA成分的熏蒸剂作大棚熏蒸试验。同时本研究还发现2种熏蒸剂在试验浓度下对烟蚜茧蜂成蜂具有较强毒性，所以熏蒸要严格控制在繁蜂前后大棚空置时进行。

在本研究所采集的真菌样本中，除了蚜虫枝孢霉，还包括一些植物病原真菌（青霉、镰刀菌等），表明这2种熏蒸剂可以杀灭多种植物病原真菌，鉴于此，该方法还可以推广至烤烟育苗阶段，用于防治烤烟苗期病害。

4 结论

造成福建省繁蜂棚内蚜虫大量死亡的虫生真菌为蚜虫枝孢霉（Cladosporium aphidis），且广泛存在于繁蜂棚内。

利用TCCA或CLO2熏蒸处理，可以有效杀灭空间内的蚜虫枝孢霉；利用含TCCA成分的熏蒸剂熏蒸繁蜂棚，可降低蚜霉病的发生率，提高繁蜂效率。

本研究证明了利用熏蒸的方法可有效解决烟蚜茧蜂繁蜂棚内的蚜霉病危害问题，该方法可在我国南方烟区烟蚜茧蜂繁蜂基地推广应用。同时在试验过程中作者发现试验选用的2种熏蒸剂还可杀灭多种植物病原菌，其中也包括能够引起烤烟病害的病原菌，基于这2种药剂高效、低风险的特性，其在烤烟病害防治方面的利用价值还有待进一步研究开发。

致谢

本文在成文过程中得到了福建农林大学张绍升教授、陈凤平副研究员的大力支持和帮助。作者在此表示衷心感谢！

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：ZHOU Ting, CHEN Tao, ZHANG Ying, et al. Identification and control of pathogen of aphid mildew in infectedAphidius gifuensisAshmaed in reproducing house [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017,23(3)

*Corresponding author.Email：gugang318@163.com

Identi fi cation and control of pathogen of aphid mildew in infected Aphidius gifuensis Ashmaed in reproducing house

ZHOU Ting1, CHEN Tao2, ZHANG Ying2, LIN Tianran3, LIN Yong4, LIN Shuiliang2, GU Gang1*
1 Institute of Tobacco Science, Fujian Provincial Tobacco Company, Fuzhou 350003, China;2 Institute of Tobacco Science, Fujian Sanming Tobacco Company, Sanming 365000, China;3 Institute of Tobacco Science, Fujian Longyan Tobacco Company, Longyan 364000, China;4 Institute of Tobacco Science, Fujian Nanping Tobacco Company, Nanping 353000, China

In order to explore the causes and control techniques for aphid mildew, fungi on deadMyzus persicaeand in the air were isolated from reproducing house whereAphidius gifuensisAshmaed were feeded. ITS region and morphological characters were used to identify pathogen. Results showed thatCladosporium aphidiswas the pathogen causing aphid mildew in reproducing house. A hermetic chamber were fumigated by Trichloroisocyanuric acid (TCCA) and chlorine dioxide (ClO2) at two dosages, 0.5g/m3and 1g/m3. The elimination rate of the two doses of TCCA was 92.31% and 92.31%, with responding control efficacy of 80.00% and 83.33% onCladosporium aphidis. The elimination rate of two doses of ClO2 was 97.88% and 83.35%, with responding control efficacy of 100% and 93.33%. The control efficacy in reproducing house was 69.65% by fumigation using a disinfectant with TCCA.

Aphidius gifuensisAshmaed；reproducing house；fumigation；Cladosporium aphidis；aphid mildew disease

周挺，陈涛，张瀛，等. 烟蚜茧蜂繁蜂棚蚜霉病病原鉴定及防治研究[J]. 中国烟草学报，2017,23（3）

中国烟草总公司福建省公司科技项目“烟蚜茧蜂防治蚜虫技术应用”

周 挺（1984—）硕士研究生，农艺师，主要从事烤烟病虫害防治方面研究，Tel:0591-87721055，Email:fjyczhouting@126.com

顾 钢（1965—），Tel:0591-87721961，Email:gugang318@163.com

2016-09-05；< class="emphasis_bold">网络出版日期：

日期：2017-03-14