普通烟草长叶柄突变性状的遗传分析

陈果，吴新儒，屈旭，晁江涛，向小华,3，胡军华，陈浣，王新，刘贯山，王元英，王绍美

1 中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草基因资源利用重点实验室，青岛266101；2 青岛中烟种子有限责任公司 青岛 266101；3 海南雪茄研究所，海南海口 571000

普通烟草长叶柄突变性状的遗传分析

陈果1，吴新儒1，屈旭2，晁江涛1，向小华1,3，胡军华1，陈浣1，王新1，刘贯山1，王元英1，王绍美1

1 中国农业科学院烟草研究所，烟草行业烟草基因资源利用重点实验室，青岛266101；2 青岛中烟种子有限责任公司 青岛 266101；3 海南雪茄研究所，海南海口 571000

叶柄是烟草叶片的重要组成部分，烟草长叶柄性状遗传分析可用于研究烟草叶柄和叶片的发育。利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变普通烟草烤烟品种中烟100和红花大金元各获得一个（极）长叶柄突变体（M48和M50），将两个突变体分别与各自的野生型中烟100和红花大金元及普通烟草烤烟品种革新三号杂交获得F1，F1自交获得F2群体，F1与其相应的野生型亲本回交获得BC1F1群体。对各类型材料进行表型调查和统计分析结果显示：F1均表现为（极）长叶柄突变表型，在F2群体和BC1F1群体中，经χ2检验，（极）长叶柄突变表型与野生型表型的理论分离比均符合3:1和1:1，表明（极）长叶柄突变性状由染色体上一对显性单基因控制。上述结果为进一步定位和克隆（极）长叶柄突变基因，揭示其在烟草叶柄和叶片发育中的作用奠定基础。

普通烟草；EMS诱变；叶柄突变；遗传分析

叶柄是烟草叶片的重要组成部分，其上端通过维管束与叶片相连，下端通过维管束与茎相连。叶片在发育过程中所需要的水、激素、营养物质等均由叶柄运输。光照和温度等环境因素可调控叶柄的生长，光信号的调控和对糖响应的调节在控制叶片和叶柄的差异形态建成中起重要作用[1]；菥蓂叶柄发育随着光周期的延长而持续伸长[2]；不同温度下大豆叶柄伸长都随光周期增长而增加[3]。内外源物质可调控叶柄的生长，叶片生长初期叶柄对外源赤霉素敏感，外源赤霉素3（GA3）的抑制剂抑制菥蓂叶柄的增长[2]；拟南芥向地性生长和叶柄长度的增长与乙烯有关[4]；草莓叶柄生长受内源激素控制[5]。相关基因也可调控叶柄的生长，如赤霉素（GA）生物合成基因GA20ox2可增加拟南芥myr1 myr2双突变体叶柄长度[6]；拟南芥CLAVATA/ESR- RELATED 6（CLE6）基因在GA缺失突变体中异位过表达促进叶柄伸长[7]；花椰菜Or基因通过抑制释放因子eRF1基因的表达控制叶柄伸长[8]；拟南芥rot3突变体植株的叶柄比野生型短[9]；拟南芥PHYB和ACL2基因只通过单个细胞的长度控制叶柄的长度，而GAI, GA1和ROT3基因似乎同时控制叶柄细胞的伸长和增殖[10]。

与叶柄相关的研究主要见于拟南芥和花椰菜。普通烟草长叶柄遗传分析的相关研究未见报道。本研究用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变普通烟草烤烟品种中烟100[11]和红花大金元[12]，获得两个（极）长叶柄突变体，并对这两个突变体进行遗传分析，确定其遗传类型，为进一步研究烟草叶柄发育的分子机理、分离和鉴定烟草叶柄发育相关基因奠定材料基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用的两个（极）长叶柄突变体M48和M50分别来源于普通烟草烤烟品种中烟100（以下简称ZY）和红花大金元（以下简称HD）经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理获得的诱变2代（M2）分离群体。突变体经自交后其（极）长叶柄性状不发生分离，表明该突变性状已经稳定存在，可以用于后续的遗传分析。

1.2 杂交组合配制与遗传群体构建

以（极）长叶柄突变体M48和M50的自交第5代为父本，分别与各自的野生型亲本ZY和HD，及普通烟草烤烟品种革新三号[13]（以下简称G3）杂交获得F1。F1自交获得F2群体，F1与其相应的野生型亲本回交获得BC1F1群体。

1.3 表型调查与统计分析

田间种植（极）长叶柄突变体M48和M50，野生型亲本ZY、HD和G3，以及相应的F1、F2和BC1F1群体，待烟草大田生育期到达团棵期至旺长期，（极）长叶柄性状发育完全时，按单株调查（极）长叶柄性状与正常野生型性状的表型分离情况，并归类统计各表型株数。用卡方检验验证F2和BC1F1群体性状的理论分离比。

2 结果与分析

2.1 （极）长叶柄突变体的表型描述

（极）长叶柄突变体在苗期突变性状不表现，生长至团棵期才逐渐表现（极）长叶柄性状，旺长期至开花期（极）长叶柄突变性状表现最为稳定和典型。

（极）长叶柄突变体主要表现为整株叶片均为（极）长叶柄突变性状表型，突变叶片是自连接主茎的叶基部起叶耳退化消失，退化消失部位延伸至叶片中部，仅剩主脉与已退化叶耳的叶柄形成一长叶柄性状，未退化部分仍形成正常叶片，叶片整体表现为与野生型带叶耳性状不同的无叶耳畸形叶性状。图1为中烟100野生型与其极长叶柄突变体M48的中部叶片比较。从照片中可见，M48突变体的叶柄长度超过叶片总长的2/3，界定为极长叶柄突变性状。图2为红花大金元野生型与其长叶柄突变体M50的中部叶片比较。从照片中可见，M50突变体的叶柄长度超过叶片总长的1/3，界定为长叶柄突变性状。此外，与其相应对照叶片的相同部位比较，（极）长叶柄突变体的叶片有明显的褶皱。从M48与M50的中部叶片照片看，两突变体叶柄长度有明显差异。对突变体M48和M50与其野生型和革新三号杂交F1和F2后代群体及相应的BC1F1分离群体的观察发现：每个杂交F1表型全部为稳定无分离的原（极）长叶柄突变表型；每个（极）长叶柄突变体的F2，BC1F1分离群体只分离出与其原突变体（极）长叶柄表型稳定相同的和与分离群体所用野生型有叶耳无叶柄表型稳定相同的两种类型。图3为长叶柄突变表型的单株照片。

图1 中烟100和M48的中部叶比较Fig.1 Comparison between Zhongyan 100 and M48 middle leaf

图2 红花大金元和M50的中部叶比较Fig.2 Comparison between Honghuadajinyuan and M50 middle leaf

图3 长叶柄突变单株Fig.3 Mutant plant of long petiole

2.2 （极）长叶柄突变体的遗传分析

2.2.1 （极）长叶柄突变体与野生型杂交的F1表型观察

为明确（极）长叶柄突变性状的遗传规律，对M48、M50野生型亲本及其相应的F1、F2和BC1F1群体进行了表型调查与统计分析。由表1可知，M48与中烟100和革新三号的F1全部表现为与M48相同的极长叶柄表型；由表2可知，M50与红花大金元和革新三号的F1全部表现为与M50相同的长叶柄表型。F1表型观察结果表明，两个突变体的（极）长叶柄突变性状为显性性状。

表1 M48及相关实验材料的表型统计与分析Tab. 1 Phenotypic statistics and analysis of M48 and related experimental materials

表2 M50及相关实验材料的表型统计与分析Tab. 2 Phenotypic statistics and analysis of M50 and related experimental materials

2.2.2 （极）长叶柄突变体与野生型杂交的F2群体表型观察与统计分析

为明确（极）长叶柄突变性状受几个基因控制，对两个突变体相应的F2群体进行了表型调查与统计分析。由表1可知，M48与中烟100和革新三号的F2分离群体中，极长叶柄突变型表型单株分别为94棵和94棵，而野生型表型单株分别为28棵和32棵，其各自的F2观测分离比分别为3.36：1和2.94：1，通过 χ2（χ2值 ＜ χ20.05=3.841）检验验证：0.273＜3.841和0.011＜3.841，均符合理论分离比3:1。由表2可知，M50与红花大金元和革新三号的F2分离群体中，长叶柄突变型表型单株分别为92棵和66棵，野生型表型单株分别为29棵和20棵，其各自的F2观测分离比分别为 3.17：1和 3.30：1，通过 χ2（χ2值 ＜χ20.05=3.841）检验验证：0.069＜3.841和0.140＜3.841，均符合理论分离比3:1。结果表明，两个突变体的（极）长叶柄突变性状皆由一对显性基因控制。

2.2.3 （极）长叶柄突变体与野生型杂交后再回交的BC1F1群体表型观察与统计分析

为进一步验证两个（极）长叶柄突变体的突变性状由一对显性基因控制，将F1用其相应的野生型亲本回交获得的BC1F1群体进行了表型调查与统计分析。由表1可知，M48与中烟100和革新三号的BC1F1分离群体中，极长叶柄突变型表型单株分别为48棵和47棵，而野生型表型单株分别为46棵和37棵，其各自的BC1F1观测分离比分别为1.04：1和1.27：1，通过 χ2（χ2值 ＜ χ20.05=3.841）检验验证：0.043＜3.841和1.190＜3.841，均符合理论分离比1:1。由表2可知，M50与红花大金元和革新三号的BC1F1分离群体中，长叶柄突变型表型单株分别为42棵和47棵，而野生型表型单株分别为48棵和37棵，其各自的BC1F1观测分离比分别为0.86：1和1.27：1，通过χ2（χ2值 ＜ χ20.05=3.841） 检 验 验 证：0.400＜3.841和1.190＜3.841，均符合理论分离比1:1。结果进一步表明，两个突变体的（极）长叶柄突变性状确实皆由一对显性基因控制。

3 讨论

本研究所用的经EMS诱变普通烟草烤烟品种中烟100和红花大金元获得的两个（极）长叶柄突变体的“长叶柄”性状是可遗传特性。在自交后代中选择与突变表型相似的稳定自交系是可行的，可以用作遗传分析。

本研究根据各类型实验材料田间表型分离观测提供的数据表明，无论突变基因是纯合或者杂合的，分离为（极）长叶柄突变表型的单株都与原突变体表型相同，即突变体的（极）长叶柄性状，且对于同一个突变体分离的突变表型，表现叶柄长度稳定；分离为野生型表型的单株与野生型的有叶耳无叶柄性状相同。在分离群体中，（极）长叶柄突变表型和野生型的性状表型不存在连续的性状变化，杂交后代可明确分为两组，两个性状可以用孟德尔的分离定律来分析，符合质量性状的定义。因此，这两个表型相似的（极）长叶柄突变性状均由染色体上一对显性单基因控制。

普通烟草叶柄有无以往多数研究认为主要受两对累加效应的基因决定[12]。有叶柄晒烟品种与无叶柄烤烟品种杂交，F1大多数表现有叶柄，说明有叶柄为无叶柄的显性或部分显性[12]。向日葵罗马尼亚Fundulea自交系O-7657中发现的“短叶柄”突变体至少由两对具有累加效应的显性基因所控制[14]；大豆短叶柄材料NJ90L-1SP和D76-1609与长叶柄材料构建9组分离群体，遗传分析证明两个短叶柄遗传材料分别受2对隐性重叠基因控制，且相互不等位，叶柄长度至少受两两重叠的四对基因控制，一些组合中只表现单基因的差异[15-16]。本研究所用的两个（极）长叶柄突变体均来自于普通烟草烤烟品种，对其构建分离群体进行遗传分析的野生型品种也是普通烟草烤烟品种，研究结果证明两个（极）长叶柄突变体的突变基因均由显性单基因控制。

通过遗传分析，本研究已经明确了两个（极）长叶柄突变体突变性状的遗传规律，但是两个突变体的叶柄长度存在明显的差异。造成这种差异的原因可能是两个（极）长叶柄突变体的遗传背景不同——分别来自两个遗传背景不同的品种中烟100和红花大金元；也可能是不同基因的不同突变造成的；还可能是同一基因的不同突变造成的，具体原因还需要通过进一步的实验研究加以证明。本研究尚未对突变表型的发育过程进行精细观察及突变叶柄切片做电镜观察，也未对两个（极）长叶柄突变体做等位测验，故不清楚M48和M50是否为同一个突变基因。进一步研究将应用基因定位与克隆技术，利用烟草基因组序列已开发获得的SSR分子标记，对控制该突变性状的基因进行定位，进而获得调控烟草（极）长叶柄发育的关键基因。

4 结论

本研究中（极）长叶柄突变体与其来源的野生型在叶片的表型上有明显差异，易于分辨，可以简单有效地进行表型性状观测和数量统计。两个（极）长叶柄突变体材料分别与野生型亲本杂交获得的F1均为突变体亲本的（极）长叶柄表型，说明两个（极）长叶柄突变性状均为显性突变；并且测交试验表型性状的观测结果分离比符合孟德尔定律1:1的理论分离比也验证了此结果；F2分离群体中两个（极）长叶柄性状的表型观测分离比同样符合孟德尔定律3:1的理论分离比，说明两个突变体的（极）长叶柄突变基因均由显性单基因控制。

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：CHEN Guo, WU Xinru, QU Xu, et al. Genetic analysis of long petiole mutant traits in Nicotiana tabacum L. [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(2)

*Corresponding author.Email：wangshaomei@caas.cn

Genetic analysis of long petiole mutant traits in Nicotiana tabacum L.

CHEN Guo1, WU Xinru1, QU Xu2, CHAO Jiangtao1, XIANG Xiaohua1,3, HU Junhua1, CHEN Huan1, WANG Xin1,LIU Guanshan1, WANG Yuanying1, WANG Shaomei1*
1 Key Laboratory for Tobacco Genetic Resources/Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao, Shandong 266101, China;2 Qingdao Zhongyan Tobacco Seed Co., Ltd., Qingdao, Shandong 266101, China；3 Hainan Cigar Research Institute, Haikou 571000, China

Genetic analysis of long petiole traits of Nicotiana tabacum L. was conducted to study the development of tobacco petiole and leaf. A long and very long petioles mutants (M48, M50) whose wild type had no petioles was obtained respectively from Nicotiana tobacum L. varieties Zhongyan100 (ZY) and Honghuadajinyuan (HD) by EMS mutagenesis. The long petiole mutants were hybridized with their own wild type Zhongyan100 and Honghuadajinyuan respectively, as well as Nicotiana tobacum L. variety Gexinsanhao (G3),resulting in the formation of F1. The F1was self-crossed to obtain F2population and were then backcrossed to respective wild types to get BC1F1population. Phenotypic investigation and statistical analysis results of all materials showed that F1was all characterized by a (very)long petiole mutation phenotype. Theoretical separation ratio of mutant phenotypes and wild type phenotypes conformed to 3:1 and 1:1 by the chi square test in F2and BC1F1populations. It was suggested that the trait of (very) long petiole mutant was controlled by a pair of dominant single gene on the chromosome. These results laid solid foundation for further (very) long petiole mutant gene mapping and cloning, revealing its role in the development of tobacco petiole and leaf.

Nicotiana tobacum L.; EMS mutagenesis; petiole mutant; genetic analysis

陈果，吴新儒，屈旭，等. 普通烟草长叶柄突变性状的遗传分析[J]. 中国烟草学报，2017, 23（2）

国家烟草专卖局烟草基因组计划重大专项项目[110201301005(JY-05)]

陈 果(1991—)，硕士研究生，专业方向：烟草突变体鉴定与利用，Tel: 0532-66715185，Email : 284687258@qq.com

王绍美(1973—)，副研究员，硕士生导师，研究方向为烟草分子育种，Tel: 0532-66715185，Email : wangshaomei@caas.cn

2016-08-17；< class="emphasis_bold">网络出版日期：

日期：2017-02-13