不同初烤烟叶叶片和烟梗TSNAs 含量及高温贮藏后的变化研究

靳彤，史宏志，周骏，白若石，杨惠娟，赵世民，王俊

1 河南农业大学烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，河南省郑州市文化路95号，450002；2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京 100024；3 河南省烟草公司洛阳市公司，洛阳471000

农艺与调制

不同初烤烟叶叶片和烟梗TSNAs 含量及高温贮藏后的变化研究

靳彤1，史宏志1，周骏2，白若石2，杨惠娟1，赵世民3，王俊1

1 河南农业大学烟草行业烟草栽培重点实验室/烟草农业减害研究中心，河南省郑州市文化路95号，450002；2 上海烟草集团北京卷烟厂，北京 100024；3 河南省烟草公司洛阳市公司，洛阳471000

为明确不同地区、不同品种、不同部位初烤烟叶叶片和烟梗TSNAs含量及其与前体物之间的关系，探明高温贮藏对TSNAs形成的影响。收集了我国河南、云贵、粤湘产区的30个烤烟初烤后烟叶样品，在河南洛阳设置品种试验，另将初烤叶片和烟梗进行高温贮藏，研究烟草特有亚硝胺、生物碱和硝酸盐含量的变化。结果表明，初烤烟叶叶片TSNAs含量均显著高于烟梗，且在叶片中NNN比例较高，在烟梗中则以NNK比例较高；叶片中生物碱总量约为烟梗的4.7倍；硝酸盐含量则表现为烟梗中含量远高于叶片。不同地区叶片TSNAs含量达到极显著差异，以湘粤产区含量最高；不同品种叶片的TSNAs含量达到显著差异，生物碱含量较低的品种TSNAs含量较低；各部位烟叶TSNAs含量均表现为叶片＞支脉＞主脉。相关分析表明在烟叶烘烤过程中烟叶生物碱含量对TSNAs积累的影响较大。经高温贮藏后叶片和烟梗TSNAs含量增加幅度有较大差异，其中烟梗TSNAs增加比例达到229.2%，叶片增加30.6%，硝酸盐含量对高温贮藏过程中TSNAs形成影响较大。

烤烟；烟草特有亚硝胺（TSNAs）；烟梗；叶片；硝酸；高温贮藏

烟草特有亚硝胺(TSNAs)是由烟草生物碱亚硝化生成的烟草中特有的有害成分，主要有4种：N-亚硝基降烟碱（NNN）、4-(甲基亚硝氨)-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)，其中NNN和NNK已被证明具有动物致癌性[1]。一般而言，在鲜烟叶中检测不到TSNAs或含量极低，TSNAs的形成和积累主要在调制和贮藏阶段[2-3]。烟叶是由叶片和烟梗组成的，其中烤烟的含梗率约占叶重的25%～30%，烟梗也是卷烟生产中重要的原料之一。目前对烟梗中TSNAs形成的研究报道较少。

TSNAs含量与生物碱和硝酸盐的含量有密切关系。史宏志等[4]研究表明 ,烟叶中TSNAs的形成受烟草生物碱和亚硝酸盐的双重影响。有关研究也证明，烟叶中烟草生物碱和TSNAs有直接的相关关系[5-9]。Fischer[10]认为烟草中NO3-水平可能是TSNAs积累的一个指示物，NO3-到NO2-的还原可能是TSNAs积累的限制阶段。贮藏条件也是影响TSNAs含量的一个重要因素[11-14]，王瑞云等[12]研究结果表明在贮藏阶段烟叶TSNAs含量大幅度增加。高温和高硝态氮含量可能是造成烟叶贮藏过程中TSNAs含量增加的主要原因[15]。本试验通过采集我国部分烤烟产区的初烤后烟叶样品，并设置品种试验，研究了初烤烟叶叶片和烟梗TSNAs含量及其与前体物之间的关系，另将初烤叶片和烟梗进行高温贮藏，研究了烟草特有亚硝胺、生物碱和硝酸盐含量的变化，旨在阐明烤烟叶片和烟梗TSNAs含量特点及与前体物的关系，为通过农业措施有效降低烤烟TSNAs含量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究收集了2015年河南烟区、粤湘烟区、云贵烟区的C3F烟叶共30个样品各2 kg。河南烟区品种为中烟100、K326；粤湘烟区品种为K326；云贵烟区品种为K326、红花大金元、云烟87。

1.2 品种对比试验

在河南洛阳设置品种试验，参试品种共6个，分别为豫烟10号、豫烟6号、豫烟12号、NC89、中烟100、LY1306。试验采取随机区组排列，每个小区试验面积200 m2。小区分3次重复，移栽规格100 cm×60 cm，种植密度16500株/hm2施氮量为52.5kg/hm2。均按当地常规方法进行栽培管理和烘烤。

1.3 高温处理试验

将贵州毕纳一号、河南中烟100、云南红大中部叶叶片和烟梗每个样品取两份，每份称取20 g。一份置于恒定的50 ℃环境内处理15 d，一份置于恒定的10℃环境内处理15 d作为对照。

1.4 测定方法

1.4.1 生物碱： 200 mg样品在碱性条件下，用甲基叔丁基醚（MTBE）提取生物碱，通过气相色谱-氢火焰离子化检测器（GC-FID）(Agilent 7890A，Agilent Technologies，USA) 定量分析检测其中5种生物碱的含量，具体参照Jack 和Bush的方法[16]。

1.4.2 硝酸盐：用1%的醋酸溶液提取烟叶中的NO3-，然后用锌粉在一定的pH值下将NO3-还原为NO2-，NO2-与对氨基苯磺酸和α-萘胺发生重氮化-偶联反应，生成红色偶氮物质，在540 nm下，用721分光光度计予以测定[17]。

1.4.3 TSNA：样品均由上海烟草集团北京卷烟厂进行测定。测定方法为在线SPE-液相色谱质谱联用（SPE-LC-MS/MS） 法（SPE-LC：Spark Holland,Symbiosis (Pico)；MS/MS：AB Sciex triple quad 5500）。称取1.0 g烟样，将其放入50 mL锥形瓶中，加入40 µL 4种氘代TSNAs（内标）溶液（5 000 ng/mL）和30 mL 100 mmol/L乙酸铵水溶液，在室温下用振荡器（200 r/min）萃取60 min，萃取液过0. 45 µm水相滤膜后使用LC-MS/MS检测TSNAs含量[18]。NNN、NNK、NAT和NAB含量之和即为TSNAs总量。

1.5 数据处理和统计方法

试验数据采用SPSS 22 统计软件进行方差分析和相关分析，由LSD法分析均值差异的显著性，显著水平P＜0.05，以a、b、c表示其差异性，数字后不含有相同字母表示差异有统计学意义；采用Excel 2007软件绘图制表。

2 结果与分析

2.1 不同烤烟叶片和烟梗TSNAs及前体物含量分析

2.1.1 烤烟叶片和烟梗TSNAs及其前体物含量分析

将粤湘、河南、云贵产区的烤烟叶片、烟梗的TSNAs含量进行综合分析(表1)，发现烘烤结束后的叶片中TSNAs含量显著高于烟梗，叶片TSNAs含量平均值为124.90 ng/g，烟梗平均含量为23.05 ng/g。四种特有亚硝胺在叶片和烟梗中所占的比例有所不同，在叶片中NNN所占比例较大，NAB含量较少；烟梗中NNK的含量较高，NAB的含量较低。从表1也可以看出叶片和烟梗不同样品间TSNAs含量的变化范围比较大。

对各地烤烟叶片和烟梗的生物碱和硝酸盐进行测定（表2），通过分析叶片和烟梗中硝酸盐的含量可知，烟梗中硝酸盐的含量远高于叶片。在叶片和烟梗中生物碱和硝酸盐的变异系数相比都表现为硝酸盐的变异系数较大。生物碱在叶片和烟梗中所占的比例都表现为烟碱＞新烟草碱＞降烟碱＞假木贼碱，其中烟碱在叶片和烟梗中含量较高，假木贼碱含量较低。叶片中生物碱的含量明显高于烟梗。

表1 烤烟叶片和烟梗TSNAs含量变异性分析Tab.1 Variance analysis of TSNAs content in fl ue-cured tobacco lamina and midrib

表2 烤烟叶片和烟梗TSNAs前体物含量变异性分析Tab.2 Analysis of the variation of TSNAs precursor content in fl ue-cured tobacco lamina and midrib

2.1.2 不同产区烤烟TSNAs及前体物含量差异性分析

通过对不同产区烤烟TSNAs及其前体物含量的汇总分析（表3），发现各产区中叶片TSNAs含量粤湘＞河南 ＞云贵，且各地区之间达到极显著差异；烟梗中TSNAs含量粤湘＞河南＞云贵。

三个产区中叶片生物碱的含量粤湘＞河南＞云贵，粤湘烟区与河南、云贵烟区达到显著差异；三个产区之间烟梗的硝酸盐含量都达到显著差异。

2.1.3 不同品种间烤烟TSNAs及前体物含量差异分析

不同品种叶片中TSNAs含量达到显著差异，参见表4。根据同一地区不同品种之间TSNAs含量和前体物含量的差异，降低TSNAs含量可以从烤烟品种入手。

表3 不同产区烤烟TSNAs及前体物含量分析Tab. 3 Analysis on the content of TSNAs and precursor in fl ue-cured tobacco from different producing areas

表4 河南洛阳不同品种间TSNAs及其前体物含量的差异性分析Tab. 4Analysis on the difference of the content of TSNAs and its precursor in different varieties in the region of Henan

2.1.4 不同部位间烤烟TSNAs及前体物含量差异性分析

表5表明云南红大各部位叶片、主脉、支脉之间TSNAs、生物碱和硝酸盐含量存在差异，三个部位烟叶中TSNAs含量都表现为叶片＞支脉＞主脉，其中上部叶和下部叶之间TSNAs含量达到显著差异水平，生物碱含量也表现出相同规律，而硝酸盐含量则表现为主脉＞支脉＞叶片。不同品种、不同部位间TSNAs含量达到显著差异而地区间则达到极显著差异，由此可知地区间的差异大于品种和部位。

表5 叶片、支脉、主脉TSNAs及前体物含量分析Tab. 5 Analysis of leaf, branch and stem of TSNAs and precursor content

2.2 初烤烟叶TSNAs含量与生物碱、硝酸盐含量相关性分析

各地烤烟样品的相关分析表明，初烤烟叶叶片和烟梗样品的TSNAs含量与生物碱含量呈极显著正相关关系，而硝酸盐含量与TSNAs含量为显著负相关关系（表6）。因此叶片和烟梗TSNAs的差异可能主要与生物碱的差异有关。TSNAs含量与生物碱的相关系数较高，表明初烤烟叶TSNAs含量与其前体物生物碱含量的关系较大。分别对烟叶和烟梗TSNAs含量与前体物关系进行相关分析，发现其相关性小于上述烟叶和烟梗合并进行的相关性，其中叶片总TSNAs与生物碱和硝态氮的相关系数分别为0.27和0.19，烟梗总TSNAs与生物碱和硝态氮的相关系数分别为0.59和0.31。

表6 TSNAs含量与生物碱、硝酸盐含量的相关分析Tab. 6 Correlation analysis between TSNAs content and nicotine and nitrate content

2.3 高温处理对叶片和烟梗TSNAs含量的影响

将贵州毕纳一号、河南中烟100、云南红大叶片、烟梗分别进行15 d高温处理，结果如图1、图2所示，三个地区叶片、烟梗经高温贮藏后TSNAs含量均有不同程度增加，增加量都达到显著水平，其中烟梗增加倍数明显多于叶片。

经高温处理后叶片的TSNAs含量与低温对照相比都达到显著差异，烟梗则达到极显著差异，其中贵州毕纳一号烟梗经高温处理后TSNAs含量高于叶片。三种叶片经高温处理后平均增加30.55%；三种烟梗平均增加229.25%，其中贵州毕纳一号烟梗增加量最大为213.44 ng/g，提高384.83%。王瑞云等[19]研究发现经高温处理后较高的硝酸盐含量加速了TSNAs的形成。由此看出在高温贮藏过程中烟梗TSNAs的增加值远大于叶片，而烟梗硝酸盐含量远高于叶片，可以推测在贮藏过程中硝酸盐对TSNAs形成有影响。

图1 高温处理对烤烟叶片TSNAs含量的影响Fig.1 Effect of high temperature treatment in the fl ue-cured tobacco leaves on TSNAs formation

图2 高温处理对烤烟烟梗TSNAs含量的影响Fig. 2 Effect of high temperature treatment in the fl ue-cured tobacco stems on TSNAs formation

3 讨论

本研究表明我国不同烟区烤烟初烤烟叶叶片和烟梗的TSNAs含量差异极显著，这与烟区土壤、施肥等条件不同导致烟叶性状和化学成分差异有密切关系。同一产区不同品种间TSNAs含量也达到显著差异。余义文等[20]研究也表明烤烟不同品种间TSNAs存在较大差异。

初烤烟叶中TSNAs含量测定结果表明，叶片中TSNAs含量显著高于烟梗，这与叶片和烟梗中TSNAs前体物含量密切相关。比较叶片和烟梗中前体物含量可以发现，叶片中生物碱的含量大于烟梗，而烟梗中硝酸盐的含量明显高于叶片；相关分析表明，烘烤后烟叶样品的TSNAs含量与生物碱含量正相关显著，而与硝态氮含量呈负相关，说明叶片中较高的TSNAs含量可能主要归因于叶片中较高的生物碱含量，而受硝态氮影响较小。经高温贮藏后，叶片和烟梗中TSNAs含量显著增加，但烟梗中TSNAs的增加量明显高于叶片，这与烟梗中硝态氮含量较高密切相关，在贮藏过程中生物碱的含量相对较为稳定，而硝态氮则易在高温条件下产生气态氮氧化物，进而与生物碱反应生成TSNAs，孙榅淑等[21]研究表明烟叶硝态氮含量与高温贮藏过程中TSNAs的形成关系密切,所以硝态氮含量较高的烟梗更利于TSNAs的形成。由于烟叶烘烤和贮藏阶段都是TSNAs形成的重要阶段，且与前体物含量密切相关，因此，通过生态、品种、农艺措施相结合控制TSNAs前体物含量及控制贮藏环境温湿度可以有效降低烟草特有亚硝胺形成和积累。

4 结论

1、不同地区、品种和部位间初烤烤烟叶片TSNAs含量均有显著差异，其中地区间的差异达到极显著差异；不同部位间烟叶TSNAs含量均表现为叶片＞支脉＞主脉；2、初烤烟叶叶片生物碱含量高于烟梗，烟梗硝酸含量显著高于叶片，TSNAs含量与生物碱相关性相对较高；3、经高温处理后烟梗TSNAs增加比例显著高于叶片，高温贮藏过程中TSNAs形成可能与硝酸盐含量更为密切。降低烤烟TSNAs含量必须从降低前体物含量和控制贮藏环境两方面入手，特别是烟梗应避免在较高温度下贮藏。

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：JIN Tong，SHI Hongzhi，ZHOU Jun, et al. TSNAs contents in lamina and midrib of fl ue-cured tobacco and their changes after high temperature storage [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(2)

*Corresponding author.Email：shihongzhi88@163.com

TSNAs contents in lamina and midrib of fl ue-cured tobacco and their changes after high temperature storage

JIN Tong1，SHI Hongzhi1*，ZHOU Jun2，BAI Ruoshi2，YANG Huijuan1, ZHAO Shimin3，WANG Jun1
1 Tobacco Cultivation Key Laboratory of Tobacco Industry/Tobacco Harm Reduction Research Center, Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002, China;2 Beijing Cigarette Factory, Beijing 100024, China；3 Henan Luoyang Tobacco Company, Luoyang 471000, Henan, China

Thirty fl ue-cured tobacco samples from Henan, Yunnan, Guizhou, Hunan and Guangdong were collected and a variety test was set up in Luoyang, Henan province to investigate the relationship between TSNAs content and their precursors in fl ue-cured tobacco lamina and midrib, and e ff ect of geographic location, variety and leaf position on this relationship. Flue-cured tobacco lamina and midrib were stored at 50℃ to study the e ff ect of high temperature storage on contents of TSNAs, alkaloid and nitrate. Results showed that content of TSNAs in fl ue-cured tobacco lamina was signi fi cantly higher than in midrib, and the highest proportion in lamina was NNN, whereas the highest percentage in midrib was NNK. Total alkaloids in lamina were about 4.7 times higher than in midrib. Nitrate content in midrib was higher than in lamina. TSNAs content in lamina varies signi fi cantly between regions, with the highest content in Hunan and Guangdong.Significant differences were found in TSNAs content of lamina between varieties, and the changes of TSNAs were closely related with alkaloid content. Lamina had the highest TSNAs content, followed by side-vein and mid-vein. Correlation analysis revealed that accumulation of TSNAs in tobacco was mainly a ff ected by amount of alkaloid accumulated during fl ue-curing. TSNAs content of midrib and lamina under 50℃ storage increased 229.2% and 30.6%, respectively, compared with that in low temperature, suggesting that nitrate levels had greater in fl uence on TSNAs formation during high temperature storage.

fl ue-cured tobacco; TSNAs; midrib; lamina; nitrate; high temperature storage

靳彤，史宏志，周骏，等. 不同初烤烟叶叶片和烟梗TSNAs含量及高温贮藏后的变化研究，2017,23（2）

国家烟草专卖局减害重大专项项目：110201301022（JH-3）

靳 彤(1991—)，硕士研究生，主要从事烟草栽培生理研究，Tel:0371-63555487，Email：wo.jin.tong@163.com

史宏志(1963—)，教授，博士，博士研究生导师，从事烟草栽培生理研究，Tel: 0371-63555487， Email：shihongzhi88@163.com

2016-08-01；< class="emphasis_bold">网络出版日期：

日期：2017-02-13