miRNA—133b—3p对PC12细胞P2rx4的表达调控及细胞钙活动的实验观察

何则平+高杨+王锐

【摘要】 目的：从离体细胞水平观察miRNA-133b-3p调控P2rx4表达对神经元钙活动的影响。方法：用转染试剂将miRNA-133b-3p mimic和miRNA-133b-3p inhibitor转入PC12细胞中。转染48 h后，用荧光定量PCR的方法检测PC12细胞中miRNA-133b-3p的含量，P2rx4 mRNA的表达变化；用免疫印迹的方法检测P2rx4受体蛋白的表达变化；用胞内钙成像技术检测ATP孵育后细胞中钙离子浓度的变化。结果：转染48 h后，与阴性对照组相比，加入miRNA-133b-3p mimic后PC12细胞中miRNA-133b-3p的含量明显增加，P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表达减少，ATP孵育后细胞中钙离子浓度的升高明显减弱。转染inhibitor后，细胞内miRNA-133b-3p的含量明显减少，P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表达增加，ATP孵育后胞内钙离子浓度的升高明显增强。结论：miRNA-133b-3p通过负向调控P2rx4的表达来影响细胞钙活动。

【关键词】 PC12细胞； miRNA-133b-3p； P2rx4； 钙活动； 表达调控

【Abstract】 Objective：To observe the effect of miRNA-133b-3p on the calcium mobilization of neurons by regulating the expression of P2rx4.Method：Transfection reagents and miRNA-133b-3p mimic or inhibitor were added into the culture medium of PC12 cell.After 48 hours of transfection，the expression of miRNA-133b-3p

and P2rx4 mRNA were measured by real-time PCR.Western blot method was used for quantitative analysis on P2rx4 protein.The mobilization of intracellular calcium was measured with calcium imaging technique.Result：After 48 hours of transfection，compared with the negative control group，after adding miRNA-133b-3p mimic，the expression of miRNA-133b-3p in PC12 cells was significantly increased， the expressions of P2rx4 mRNA and P2rx4 protein were significantly decreased，and calcium ion concentration increase induced by ATP was decreased obviously.After adding miRNA-133b-3p inhibitor，the expression of miRNA-133b-3p was decreased significantly，and the expressions of P2rx4 mRNA and P2rx4 protein were significantly increased，the calcium ion concentration increase induced by ATP was enhanced obviously.Conclusion：miRNA-133b-3p downregulation of P2rx4 affectes intracellular calcium activity and is involved in chronic pain.

【Key words】 PC12 cell； miRNA-133b-3p； P2rx4； Calcium mobilization； Regulation of expression

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.006

疼痛是大多数疾病共有的症状，慢性疼痛及严重疼痛已经构成一个单独的疾病[1]。不同类型疼痛的共同过程主要包括痛刺激对伤害性感受器的激活，伤害性信息的传递，痛信息在不同中枢的处理，并最终产生痛觉[2-3]。在这个过程发挥最基本、最重要作用的因素是各种痛相关的神经活性物质的产生。因此，探讨不同条件下痛相关物质的产生以及表达调控是疼痛尤其是慢性疼痛机制研究中最有可能获得具有应用价值成果的领域。

microRNA（miRNA）是一类单链非编码RNA，可以对基因组的大部分進行转录后调节[4]。哺乳动物体内超过60%的基因是miRNAs的靶基因，miRNAs在转录后水平调节蛋白质的表达，在疼痛信号产生与传递过程发挥了重要作用[5]。课题组在前期工作中，利用miRNA芯片，初步明确了CFA致大鼠慢性炎性疼痛模型DRG中miRNAs的表达谱。综合多个生物信息学数据库的预测，得到

22种与疼痛有关的靶基因，并从中筛选出已知与疼痛形成密切相关的P2rx4。

P2rx4基因编码的蛋白是P2X4受体，P2X4受体是疼痛递质ATP的受体之一，与痛觉调制密切相关[6-7]。生物信息学的分析结果提示P2rx4可能受3个差异表达miRNA调控。采用双荧光素酶报告基因法对P2rx4和3个差异表达的miRNA进行了靶结合实验，最后证实P2rx4的mRNA只与miRNA-133b-3p发生了结合。endprint

前期的在体的研究发现，慢性炎性疼痛大鼠背根神经节内miRNA-133b-3p与P2rx4之间可能存在负相关关系。提示miRNA-133b-3p可能通过调节P2rx4的表达来调控疼痛的发展变化。P2X4是ATP门控的离子通道（Ca2+通道），因此在本研究中笔者采用高分化型的雄性大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12，在细胞水平外源性的干预miRNA-133b-3p的表达，观察miRNA-133b-3p对P2rx4 mRNA和蛋白表达的调控作用以及该调控作用对ATP孵育后细胞钙活动的影响，最终证实miRNA-133b-3p可通过调控P2X4受体的表达，进而影响神经元的钙活动以及慢性疼痛的发生。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 分组 将PC12细胞分四组：Mimic组、Mimic阴性对照组（NCM组）、Inhibitor组、Inhibitor阴性对照组（NCI组）。

1.2 转染 细胞按每皿3×106/mL的密度接种。转染按riboFECTTM说明书转染。mimic和inhibitor的终浓度分别为100、150 nM。

1.3 钙离子成像 每皿加入500 μL Fura 2-AM工作液，孵育20 min，洗涤三次；加入任氏液孵育10 min，用MetaFlour系统记录荧光强度的变化。记录基线2 min，加入2 μM ATP，记录3 min，至荧光强度回到基线水平后，再加入16 μM的ATP，记录2 min。

1.4 实时荧光定量PCR 用miRNeasy Mini Kit试剂盒（Qiagen）来抽提细胞中的总RNA。用miScript? Ⅱ RT Kit试剂盒（Qiagen），将RNA溶液反转录为cDNA。以cDNA为模板，U6作为内参，用miScript SYBR? Green PCR Kit试剂盒（TaKaRa）检测miRNA-133b-3p的表达。用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa），将RNA溶液反转录为cDNA，以cDNA为模板，以大鼠的β-actin为内参，用SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒（TaKaRa）检测P2rx1-7 mRNA的表达量。

1.5 蛋白印迹 裂解细胞，提取蛋白。检测蛋白浓度，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离总蛋白，并转移到PVDF膜上。封闭1 h，漂洗，P2rx4兔一抗（1∶500，Abcam）孵育过夜。山羊抗兔HRP-IgG（1∶3000，生工）孵育1 h，凝胶成像仪成像。用蛋白印迹膜再生液洗脱已经结合的一抗和二抗，孵育GAPDH（1∶1000，生工）一抗，用内参基因来标准化P2rx4蛋白的表达水平。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0统计学软件分析，计量资料且符合正态分布用均数±标准误（Mean±SEM）表示。两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P2rx4在PC12细胞钙活动中的作用观察 P2rx有P2rx1～P2rx7七种亚型，qPCR检测其表达。与P2rx1相比，其中P2rx4在PC12细胞中的相对表达量最高（P<0.01），见图1A。向PC12细胞中分别加入P2XR受体的激动剂和抑制剂（10 ?M IVE，2 ?M PPAD，2 ?M 5BDBD）。其中IVE是P2rx4的激动剂，PPADs是P2XR（P2rx1、P2rx2、P2rx3、P2rx5）的拮抗剂，5BDBD是P2rx4的拮抗剂。钙成像结果显示：与ATP组（0.449 00±0.020 92）相比，IVE组钙离子浓度明显增加（0.651 30±0.027 46，P<0.01）；5BDBD组钙离子浓度明显降低（0.256 10±0.026 29，P<0.01）；PPADs组钙离子浓度明显减少（0.256 10±0.026 29，P<0.01）；PPADs+5BDBD组钙离子浓度明显降低（0.096 97±0.016 60，P<0.01）。见图1B。

2.2 转染miRNA-133b-3p mimic对PC12细胞的影响 转染miRNA-133b-3p mimic 48 h后，检测miRNA-133b-3p的相对含量，P2rx4 mRNA和蛋白的表达变化，以及细胞内钙活动。结果显示：与NCM组（1.505 00±0.510 70）相比，转染mimic后，miRNA-133b-3p的含量明显上升（11 450±1079，P<0.01），见图3A；与NCM组（1.015 00±0.079 43）相比，Mimic组P2rx4 mRNA的表达明显降低（0.492 50±0.049 96，P<0.01），见图3B；与NCM组（0.814 50±0.042 20）相比，Mimic组PC12细胞中P2rx4蛋白的表达明显降低（0.367 90±0.017 79，P<0.01），见图3C；与NCM阴性对照组（0.282 80±0.007 62）相比，Mimic组ΔRatio值明显降低（0.219 00±0.010 17，P<0.01），见图3D。

2.3 转染miRNA-133b-3p inhibitor对PC12细胞的影响 转染miRNA-133b-3p inhibitor 48 h后，检测miRNA-133b-3p的相对含量，P2rx4 mRNA和蛋白的表达变化，以及细胞内钙活动。结果显示：轉染48 h后，与NCI组（1.394 00±0.070 86）相比，转染150 nM miRNA-133b-3p inhibitor后，PC12细胞中miRNA-133b-3p的含量降低（0.434 40±0.082 28，P<0.01），见图4A；与NCI组（1.007 00±0.042 50）相比，Inhibitor组P2rx4 mRNA的表达明显升高（1.506 00±0.306 80，P<0.01）见图4B；与NCI组（0.726 60±0.031 06）相比，Inhibitor组P2rx4蛋白的表达增高（0.843 60±0.041 72，P<0.05），见图4C；与NCI组（0.330 80±0.007 47）相比，Inhibitor组PC12细胞中ΔRatio值升高（0.368 50±0.009 08），（P<0.01），即细胞内流的钙离子浓度增加，见图4D。endprint

3 讨论

课题组之前研究发现慢性炎性痛大鼠背根神经节内miRNA-133b-3p与P2rx4的表达可能存在负相关关系。且体外实验也证实miRNA-133b-3p可与P2rx4 mRNA的3-非编码区发生结合。因此本研究在PC12细胞内干预miRNA-133b-3p的表达，观察P2rx4 mRNA和蛋白的表达情况以及PC12细胞钙活动的改变，以期证实miRNA-133b-3p确实可以调控P2rx4的表达，并且参与细胞功能改变。

选用大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞株，研究表明，在PC12细胞系可以很好观察到ATP诱导的钙内流[8]。此外，该细胞的来源也是大鼠，因此PC12细胞为此次功能验证实验提供了一个细胞模型。

P2X嘌呤受体有七个亚型（P2X1～P2X7），是一类可以被细胞外的ATP激活的配体门控离子通道家族[9-10]。它们在疼痛信号的产生和传递过程中发挥的作用[11-12]。笔者检测了PC12细胞中P2X各种亚型的基础表达量，结果显示，PC12细胞中的P2rx4在钙内流过程中发挥着显著的作用。P2rx4的表达水平最高，且激活P2rx4通道后，细胞内的钙内流明显增加。以上结果表明，PC12细胞是研究P2rx4表达量和功能变化的很好的模型。

研究发现，miRNA通过抑制或降解靶基因发挥调控作用的[13-14]。在本研究中，笔者发现，

100 nM miRNA-133b-3p mimic的转染能明显增加PC12细胞中miRNA-133b-3p的含量，P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表达在细胞中miRNA-133b-3p的含量增加后明显降低。而150 nM miRNA-133b-3p inhibitor的转染能明显降低PC12细胞中miRNA-133b-3p的含量，能够模拟细胞内miRNA的低表达。P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表达在细胞中miRNA-133b-3p的表达受到抑制后明显增加。结果表明，PC12细胞转染miRNA-133b-3p mimic后，细胞内miRNA-133b-3p的含量增加，P2rx4 mRNA水平和蛋白水平的表达均降低；而转染miRNA-133b-3p inhibitor后，细胞内miRNA-133b-3p的含量减少，P2rx4 mRNA水平和蛋白水平的表达均升高。所以，这部分结果充分证实了miRNA-133b-3p确实是可以负向调控P2rx4的表达的。

在证实miRNA-133b-3p确实可以负向调控P2rx4的表达之后，笔者对细胞的功能变化进行了观察。结果发现，miRNA-133b-3p模拟物可以减弱PC12细胞内ATP诱导的钙离子的内流。而 miRNA-133b-3p抑制剂可以增加PC12细胞内ATP诱导的钙离子内流。因此，结果表明，转染miRNA-133b-3p mimic降低P2rx4蛋白的表达之后，细胞在受到ATP刺激后，细胞钙内流减少；此外，在转染miRNA-133b-3p inhibitor增加P2rx4蛋白的表達后，ATP诱导的细胞钙内流增加。本实验对miRNA-133b-3p通过调控P2rx4蛋白表达影响PC12细胞钙活动提供了正反两个方面的证据。

背根神经节内神经元胞内Ca2+信号与慢性疼痛的发展发展密切相关[15-17]。外周组织受到强烈的伤害性刺激导致受刺激细胞或神经末梢释放致痛物质ATP，ATP可与外周伤害性信息传入初级感觉神经元上的P2受体结合，使神经元细胞内Ca2+浓度升高，激活ERK-CREB信号转导通路，从而激活转录因子CREB启动转录，诱导背根神经元疼痛相关基因蛋白的表达，最终增强初级感觉神经元的兴奋性[18-20]。

综上，本实验证实miRNA-133b-3p通过负向调控P2rx4基因的表达，影响神经元钙活动及其兴奋性，最终参与慢性疼痛的形成。

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（收稿日期：2017-05-17） （本文編辑：程旭然）endprint