LPS诱导鼠急性肺损伤模型的评价分析

温保强　刘江华

【摘要】 急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是通过干扰与肺泡毛细血管屏障有关的临床急危重症。过去由于对ALI和ARDS机制研究不清、临床上没有针对性治疗方法，导致疾病的死亡率很高。近年来，随着利用脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）创建ALI动物模型实验的研究的不断深入，在ALI模型的建立及其机制方面有了较新的进展，新的研究指导临床有望降低ALI和ARDS的死亡率。本文对LPS诱导鼠急性肺损伤不同模型进行评价分析，以便广大研究者对急性肺损伤动物模型建立和研究提供进一步认识，为前临床研究提供动物实验基础。

【关键词】 急性肺损伤； LPS； 鼠模型

Evaluation and Analysis of LPS Induced Acute Lung Injury in Mouse/WEN Bao-qiang，LIU Jiang-hua.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：137-140

【Abstract】 Acute lung injury and acute respiratory distress syndrome are caused by disturbing clinical acute and severe complications associated with alveolar capillary barrier.In the past due to ALI and ARDS mechanism are unclear，there is no spcific clinical treatment，and resulting in a high mortality rate of the disease.In recent years，with the deepening of the study of ALI animal model experiments with using LPS，new progress has been made in the establishment and mechanism of ALI model.New research has suggested that clinical trials are expected to reduce the mortality of ALI and ARDS.In this paper，we evaluated the different mouse models of acute lung injury induced by LPS，in order that researchers could further develop the animal model of acute lung injury and provide the animal experimental basis for the preclinicalstudy.

【Key words】 Acute lung injury； LPS； Mouse model

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530007，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.036

目前，在已發表通过对急性肺损伤动物模型的实验研究中，研究人员发现活化多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）在肺组织内的聚集的现象，在ALI和ARDS的发展中发挥关键作用[1-2]。然而PMN移动到肺部不同部位引起ALI和ARDS的原理尚未完全阐明。目前用于研究PMN与ALI和ARDS的关系主要方法为在LPS诱导下复制肺损伤鼠模型[3-4]，来阐明LPS刺激对化学引诱物的反应增加炎症部位的PMN迁移的作用。虽然单独使用LPS没有预先考虑存在的疾病、液体复苏或机械通气等客观条件的存在[5-6]，无法反映整体人类疾病的复杂性，但是通过对鼠肺损伤模型过程的，能够在一定程度上反映模拟体内ALI和ARDS的病理生理状态[7]，为前临床研究提供研究思路。本文就LPS急性肺损伤模型建立总结和分析，为前临床研究提供动物实验基础提供合适的参考。

1 LPS诱导下复制肺损伤机制

内毒素模型的基础：LPS是一种糖脂，是存在于组成革兰氏阴性细菌的外膜中的极性脂质头组（脂质A）和链重复二糖[8]。LPS大多数的生物学效应是由脂质A复制的，即使存在或不存在寡糖O抗原的影响。在血清中，LPS与α结合特异性LPS结合蛋白（LBP）[9]形成一种LPS：激活关于单核细胞，巨噬细胞和其他细胞的CD14/TLR4受体的LBP复合物，触发炎症介质的产生[6]。LPS是脓毒血症的重要介质，利用机体对革兰阴性细菌的反应进行全身给药，导致细菌性败血症，是LPS最早用于建模的原理方法之一[7]。

LPS激活循环中PMN迁移的途径，主要是通过增强白细胞的机械性能跟迁徙活动，进而使白细胞迁移到肺组织中，释放趋化性细胞因子进入支气管肺泡灌洗液（BAL），从而将趋化因子受体表达的PMN引导到肺组织中[1]。这一过程需要PMN和肺内皮之间的的粘附分子接触，一旦PMN粘附到肺血管壁，就开始经内皮迁移到肺间质和跨上皮迁移到肺泡空间。两个迁移步骤受粘附分子和趋化因子受体得调节，同时伴随着PMN、内皮细胞和上皮细胞的细胞骨架重组[10]。在大量已经研究了的各种ARDS模型中，将小鼠暴露于LPS环境中，使小鼠接触LPS诱导大量PMN迁移进入肺，能够引起ARDS典型症状，包括增加微血管的通透性，细胞因子的释放和破坏的肺结构的等病理改变[9]。endprint

通过研究PMN在不同时间在不同组织结构中的数目变化，能够提示ALI进程的变化，而收集到的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage，BAL）以及对组织HE染色，观察肺组织结构中PMN的数目改变结果，可作为诊断肺部间质疾病非常有用的工具[11-12]。它可以显示有核免疫细胞的差异细胞计数，提供或支持某些诊断的有用的细胞学变化，以及有助于明确其他测试（包括感染性病原体的培养物，恶性细胞细胞学）的诊断[9-11]。

2 利用LPS诱导的优点与缺点

2.1 优点 LPS容易管理，并且结果往往是可重复的。另外LPS是先天免疫Toll样受体（toll like receptor 4，TLR4）途径反应的有效激活剂[13]，TLR4是主要的LPS受体，一般情况下，在人类中ARDS中LPS不会导致严重内皮和上皮损伤发生[14]，故而对体外细胞直接毒性很小。另外，同時由于物种对LPS得反应具有高度的变异性，其中一方面是人类与动物不同，没有PIM。在使用LPS诱导后，肺炎可以发生在羊、小牛、猪和猫体内，但啮齿动物或狗不会产生。具有PIM的动物[15]，在以g/kg小剂量范围内的LPS诱导时就可以发展为发展脓毒症和肺损伤，而没有PIM的动物需要以mg/kg为单位的更高剂量的范围[5]。因此，使用LPS可以提供特定物种在发生细菌感染后得到相关的宿主炎症反应的信息。

2.2 缺点 LPS制剂通常含有污染物，如细菌脂蛋白，可能会影响通过与TLR以外的相互作用，影响LPS的生物学作用。另外LPS制剂的纯度不同，可能会受到细菌脂蛋白和其他细菌材料的污染。因此，使用LPS可能得到肺中的细菌引起炎症反应的不完整的过程[16-17]。

3 LPS诱导急性肺损伤不同给药方式的特征

3.1 静脉给药 静脉注射LPS后，毛细血管内皮是损伤的初始部位，LPS诱导的细胞损伤似乎与细胞凋亡有关，内皮细胞而在其他组织损伤之前，其凋亡速度迅速发展。静脉注射LPS的血液动力学反应，主要有初始阶段的白细胞减少，心脏输出量的较少和动脉压下降。同时肺动脉压升高，主要是由于增加在后毛细血管阻力。这个初始阶段肺的变化在2～4 h内明显，并含有低氧血症，但是只有少量的PMN迁移到肺泡腔中[17]。静脉注射LPS引起脓毒性休克的效果明显，当研究人员用1 mg LPS静脉注射时，小鼠在3 h内发生高血压反应，同时导致血管内凝血、肝脏异常、肾功能和非心源性肺水肿。LPS得静脉注射剂量范围从2～4 ng/kg6的时候可以得到全身炎症的证据相关，并引发肺泡巨噬细胞得迁移[17]。

3.2 气管内给药 气管内滴注LPS可以使PMN经内皮迁移到肺间质和跨上皮迁移到肺泡空间，使肺泡腔内的PMN大幅增加，便于直接引起肺部炎症反应[11，17]。同时气管内滴注LPS，剂量范围在1～4 ng/kg5，以PMN数量增加为特征，在BAL液中PMN，白蛋白和促炎症细胞因子（TNF-α，IL-1β，IL-6，G-CSF，IL-8，ENA-78，MCP-1，MIP-1α和MIP-1β）、单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞计数在24～48 h后增加。

4 LPS诱导下急性肺损伤鼠模型选择

（1）急性肺损伤实验动物模型的选取，主要从实验动物的可操作性、可重复性、动物对试剂的敏感性、药物吸收的速度、试剂剂量的浓度要求、造模成功后是否易观察到明显的变化、购买实验动物所需的经费等方面考虑[7]。（2）实验设计选择ALI的动物模型另一个个重要的考虑因素，动物大小尤影响在生理参数如动脉氧张力和平均动脉压的监测上；影响着实验人员是否能更容易获得足够量的血液或以获得较大物种中的多种血液样品，如血气，血浆细胞因子和白细胞计数的重要因素。（3）由于成本限制，所需试剂的数量和可用性等，可以让实验人员考虑限制使用较大的物种。（4）研究人员由于经常面临缺乏用于测量ALI的发病机制相关炎症的物种特异性试剂、介质、受体或其他蛋白质等因素，都影响着鼠模型的选择[17]。

目前有根据对LPS的敏感度，大多数研究选取LPS的诱导敏感度高SD大鼠或者转基因KM/Blac小鼠作为实验动物。

SD大鼠：体型较大，操作空间大，易于进行注射、解剖等操作，尤其是给药的方式以及剂量对试验人员的技能要求不高；但是其所需LPS剂量会相应增多，同时对LPS试剂的敏感性不如小鼠，LPS的作用的效果相对于小鼠来不如其明显。

转基因KM/Blac小鼠：体型小，重量轻，所需要的LPS剂量浓度少，对LPS较敏感，既能够节约实验成本，同时又满足短时间内的观察到明显病理变化实验需求，并且可重复性好[18]。但是其体型较小，给药操作空间局限，对操作技能的要求较高。然而当今被用于研究人类疾病的小鼠模型被广泛使用，具体试剂的可用性和发展，能够较为全面的评估的转基因小鼠的特定基因的生理功能。故而转基因小鼠在肺部炎症过程的研究得到了一些很好的评论[17]。

5 LPS诱导下复制肺损伤鼠模型制备

使用同的给药方式（包括经气道、经静脉等11方式），使小鼠暴露于LPS环境中。在LPS暴露后不同时间（0、2、4、6、12、24、48 h）[12-14]，通过腹膜内注射氯胺酮或者水合氯醛麻醉小鼠。

用23号套管在心室插管，并在25 cm水柱压力下下缓慢注入10 mL PBS反复灌洗肺组织约6次，取出肺泡灌洗液[12]。同时将肺切除，切碎，消化，置于保存液中，通过将消化的肺通过70 μm细胞过滤器制作成细胞悬液，上清BCA法测灌洗液蛋白浓度；沉淀重悬后，甩片机做细胞甩片后Gimsa染色，比较肺泡灌洗液和肺组织中的中性粒细胞数量和比例。

分离出完整肺组织用1 mL 10%甲醛固定，注射固定后可将整个肺投入10%甲醛固定液10 h后；水洗、脱水、包埋、石蜡切片，进行HE染色，观察肺组织中白细胞聚集情况[12，15]。同时通过烘干机测定肺湿干重比例。endprint

6 讨论

急性肺损伤模型的成功建立，是研究ALI/ARDS的病理变化的基础[19]。在LPS诱导的急性肺损伤模型中，通过研究PMN迁移到肺的不同组织中的顺序来研究急性肺损伤病理变化。大量的研究结果表明，通过对实验组跟对照组之间的比对，LPS诱导的PMN迁移到肺和BAL中的时间与动物在LPS中暴露导致时间呈依赖性。国外的一项研究表明，在高峰期反应中，中性粒细胞占肺内白细胞总数的（74±7）%，PMN的绝对和相对计数在4 h的时候迅速增加直到达到峰值，而4 h后，肺组织中的PMN计数减少并降低到在LPS暴露后24 h后的基线水平，空白对照组则无以上关系[6]。BAL的结果，在未暴露于LPS环境中时，BAL中未观察到PMN。PMN被诱导进入肺组织组织的时间相对延后[2]，而第一个PMN出现在暴露于LPS中2 h后。在2～4 h，嗜中性粒细胞在BAL中聚集非常明显。48 h后，BAL中的细胞计数开始减少但没有达到基线。通过确定血管渗漏，可以在LPS吸入模型中确认肺损伤。在肺组织切片中可见明显的炎症反应，炎性细胞浸润明显，渗出的炎症细胞可见于肺泡内和肺泡隔的结缔组织。尤其是肺血管及各级支气管周围中性粒细胞滞留、聚集明显[20]。此外，肺组织还可见充血、水肿、肺泡膈增厚，甚至肺泡壁表面可见早期透明膜形成[21]，可见LPS诱导的急性肺损伤模型是较为有效的。

因此考虑具体情况后，结合所需要模型的特征以及实验参数，LPS诱导的鼠模型是较为适合模型：而决定急性肺损伤鼠型成功与否则于以下因素相关：（1）实验动物动物对LPS的敏感度。本文经过对已报导发表的中外文献的对比研究中发现，在KM/Blac小鼠上应用LPS建立急性肺损伤模型方面，其病理组织变化、生化改变等较SD大鼠大鼠明显。（2）给药途径方面，经过对大量文献的对比评价，在雾化吸入、气管内滴注、尾静脉注射、腹腔注射的给药途径中，通过报道文中肺组织病理变化改变、肺泡灌洗液中炎性因子浓度方面的对比，发现雾化吸入方式最优、依次是气管内滴注、尾静脉注射和腹腔注射等。（3）在观察时间点上，国内外文献报道有较大差异，其中6、12、24 h被较多的选为观察点，其中6 h在早期病理组织变化中较为明显，24 h在后期的病理组织切边、炎性细胞浓度、炎性因子浓度方面可被明显观测到，尤其以经气道给药方式，在24 h时间点观察，能够得到较为满意的实验数据。综上，在急性肺损伤模型建立的过程中，LPS诱导的小鼠模型是一个较好的选择：取标本、评估的肺泡毛细血管通透性和炎症的响应相应方便，不仅节约成本及操作时间，其可重复性和对试剂的敏感性较高。

总之，使用LPS诱导ALI/ARDS鼠模型，因其可重复性高、敏感度好、成本低等优势，在目前研究ALI/ARDS仍然存在至关重要的意义诱导的动物小鼠模型作为生成有关信息的工具，在肺损伤的病理生理学和测试新型治疗方法以及复杂生物系统的干预等方面应用广泛。通过LPS诱导小鼠模型了解ALI的病理生理和发展，能够加快人类对ALI/ARDS的新型治疗方案的研究进展，提高动物模型的肺損伤的数据的有用性。

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（收稿日期：2017-07-11） （本文編辑：程旭然）endprint