经介入途径多疗法、多基因联合治疗肝癌的可行性分析

曹长春　马红霞　杨迪

【摘要】 目的：分析探讨经介入途径多疗法、多基因联合治疗肝癌的可行性。方法：选取2013年11月-2016年11月120只大白兔建立肝癌模型，按照随机数字表法分为五组，每组24只。第一组为单纯超液化碘油栓塞组，第二组为超液化碘油+P53（质粒-脂质体复合物）组，第三组为超液化碘油+TK/CD（浓缩的TK-CD逆转录病毒上清），第四组为超液化碘油+P53+TK/CD组，第五组仅进行生理盐水治疗（对照组）。对五组大白兔进行常规的病理检查和生存期观测。结果：各治疗组肿瘤体积增长率均较对照组明显下降，其中第四组肿瘤增长率抑制最为有效，差异均有统计学意义（P<0.05）；对照组瘤兔介入术后20～40 d相继全部死亡，治疗组在观察期内自然死亡30只（31.3%），第一组12只（50.0%），第二组9只（37.5%），第三组7只（29.2%），第四组2只（8.3%），五组瘤兔生存情况比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：介入基因疗法能够克服介入治疗的副作用，有效地抑制肿瘤的生长，延长瘤兔的生存时间。

【关键词】 介入； 多基因； 肝癌； 可行性

Feasibility Analysis of Combined Therapy and Multiple Gene Therapy for Hepatocellular Carcinoma/CAO Chang-chun，MA Hong-xia，YANG Di.//Medical Innovation of China，2017，14（26）：029-032

【Abstract】 Objective：To investigate the feasibility of combined therapy and multiple gene therapy in the treatment of liver cancer.Method：A total of 120 rabbits from November 2013 to November 2016 were selected to establish the model of liver cancer，and they were randomly divided into 5 groups according to random number table method，24 cases in each group.The first group was given pure lipiodol embolization group，the second group was given lipiodol+P53（plasmid liposome complex） group，the third group was lipiodol+TK/CD（TK-CD retrovirus supernatant concentration），the fourth group was given lipiodol+P53+TK/CD group，the fifth group only saline the treatment （control group）.Five groups were examined by routine pathology and their lifetime were observed.Result：Compared with the control group，the tumor volume growth rate of the other groups decreased significantly，the fourth group was the most effective，the differences were statistically significant（P<0.05）.Rabbits of the control group had all died after PCI 20-40 days，natural death of the other groups in the observation period was 30 cases（31.3%），the first group was 12 cases（50.0%），the second group 9 cases（37.5%），the third group was 7 cases（29.2%），the fourth group was 2 cases（8.3%），the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Interventional gene therapy can overcome the side effects of interventional therapy，effectively inhibit the growth of tumor and prolong the survival time of tumor rabbits.

【Key words】 Intervention； Polygene； Liver cancer； Feasibility

First-authors address：The First Peoples Hospital of Lanzhou，Lanzhou 730050，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.26.008

肝癌（HCC）在世界惡性肿瘤中排名第五，是继胃癌、食管癌之后引起死亡的第三大原因[1]。我国是肝炎大国，肝癌的发病率世界上最高，患者在初期时症状不明显，大部分患者就诊时已经为晚期，主要表现为乏力、黄疸、肝区疼痛、腹水等，出现典型的临床表现时大部分已经不能够进行手术，其他的治疗方法效果不理想，而且预后较差[2]。目前治疗肝癌的众多方法中手术仍旧为首选的方式，复发率较高，因此肝癌治疗的关键为有效的抑制复发[3]，近年来基因治疗的研究取得了很大成果，是继化疗、放疗、手术、免疫治疗之后的第五种治疗方式，是最具有潜力的方法之一。为了进一步研究介入途径多疗法和多基因联合治疗肝癌的可行性，特选取本院120只大白兔进行研究，现报道如下。endprint

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 选取2013年11月-2016年11月6～8個月120只新西兰大白兔建立肝癌模型，体重2.0～2.5 kg，平均（2.23±0.53）kg，按照随机数字表法分为五组，每组24只。实验中使用的脂质体LipofectamineTM2000、5-氟胞嘧啶、丙氧鸟苷分别由Gibco公司、Sigma公司、Roch Syntex公司生产，pCMV-p53质粒、PA317细胞、PA317/TK-CD细胞由山东大学生物化学与分子生物学研究所赠。使用的主要设备为德国西门子公司的大C臂DSA和64排CT机。第一组为单纯超液化碘油栓塞组，第二组为超液化碘油+P53（质粒-脂质体复合物）组，第三组为超液化碘油+TK/CD（浓缩的TK-CD逆转录病毒上清），第四组为超液化碘油+P53+TK/CD组，第五组仅进行生理盐水治疗（对照组）。

1.2 实验方法 （1）通过扩增、提取、纯化等制备pCMV-P53质粒-脂质体复合物，将提取后的pCMV-P53质粒在0.8%琼脂糖凝胶中电泳，电泳需要8 V/cm电压1 h，之后进行EB染色30 min并在紫外透视仪下观察结果。为保证转染效率最高，本次研究按照P53质粒与脂质体以1∶2比例混合。（2）制备浓缩的TK-CD逆转录上清，所用PA317/TK-CD为转染pWZLneoT-KglyCD质粒（为TKcDNA及CDcDNA的复制缺陷型逆转录病毒表达载体）的稳定产病毒细胞，复苏PA317细胞以及PA317/TK-CD细胞，将得到纯化的PA317/TK-CD细胞大量培养，传代。为去除细胞碎片应收集病毒上清液并离心5 min，过滤后加入多聚赖氨酸至终浓度0.005%，混均，4 ℃孵育5 min。在4 ℃条件下以20 000 r/min离心，2 h后去掉上清，用少量培养基重融病毒颗粒沉淀得到浓缩病毒。（3）细胞建立大白兔肝癌模型需要将瘤细胞加重在兔大腿内侧腹股沟部位的皮下，使其成瘤并传代，瘤体长至1～2 cm3大约需要2周时间，手术取出代瘤株并剥落肿瘤包膜，剔除干净坏死及纤维组织，取鱼肉样肿瘤组织在平皿剪成1～2 mm3的小块，用生理盐水反复冲洗后作为瘤种备用。（4）对预接种兔进行麻醉和固定，以倒V样小弧形切口打开腹腔，打开部位为剑突下正中，检出剑突并使用小拉钩牵引暴露肝脏。用大小合适的睑板腺囊肿镊在拟接种的部位夹持肝叶并拖出腹腔外，夹持的力量为阻断局部血流循环的力度，调整并固定螺丝。刺破肝包膜，深度约为4 cm，注入1瘤块后封闭窗口，封闭可使用小块的明胶海绵并在表面涂OB胶，待凝固后撤出睑板腺囊肿镊。将肝脏还原腹腔并缝合切口，手术后给予80万单位的青霉素肌肉注射3 d。（5）手术后2周进行试验，通过CT扫面选取肿瘤直径为2 cm的荷瘤兔120只随机分为五组，使用经股动脉-肝动脉插管法，首先将实验兔麻醉并固定，切开靠近腹股沟区股动脉纵行的皮肤，剪开股动脉稍分离股动脉，远端用4号线穿过。将近丝线端提起阻断血流，在股动脉前壁剪一小“V”插入短导丝，沿导丝插入自制导管鞘并结扎固定。用3F微导管寻找腹腔动脉进行造影，确认肝固有动脉后行选择性插管，再次造影，证实肝实质显影需进一步对肝左或肝右动脉进行造影，插管成功后进行数字减影造影（使用优维显300为血管对比剂）并在透视监视下缓慢的灌注试验药品。第一组每只注入1 mL的超液化碘油，第二组每只按顺序经导管注入1 mL超液化碘油和20 ?g的P53质粒转染液，第三组每只按顺序经导管注入1 mL超液化碘油和103 PFU的TK/CD浓缩病毒，第四组每只按顺序经导管注入1 mL超液化碘油、20 ?g的P53质粒转染液、103 PFU的TK/CD浓缩病毒，第五组经导管于肿瘤供血动脉注入1 mL的生理盐水。介入操作后冲洗导管（使用1 mL肝素盐水），拔出鞘管、导管并进行结扎和缝合。术后预防感染可注射80万单位青霉素，饲养环境需保证无菌和清洁。

1.3 观察指标 对五组进行常规病理检查（术前和术后进行B超和CT扫描计算肿瘤体积=最大直径×最小直径2/2，肿瘤生长率=治疗后体积/治疗前体积）和生存期观测[4]。

1.4 统计学处理 采用SPSS 15.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘤兔治疗前后的肝脏肿瘤生长体积和生长率 各治疗组治疗前瘤体所差无几（P>0.05）；治疗后前四组肿瘤体积增长率均较对照组明显下降，其中第四组肿瘤增长率抑制最为有效，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 瘤兔生存期比较 此次试验成功建立了兔肝癌模型，整个实验过程插管以及介入治疗顺利，无死亡。肉眼观察肿瘤组织呈现灰白色圆形或椭圆形结节样，与周围的分界较为清晰，剖面呈现出鱼肉状，中央大多数具有液化性坏死灶并形成囊腔。光镜下发现切片中看不见正常的肝小叶结构，肿瘤呈明显的异型性和浸润性生长，较多核分裂相，呈现片状或巢状排列。对照组瘤兔介入术后20～40 d相继全部死亡，治疗组在观察期内自然死亡30只（31.3%），第一组12只（50.0%），第二组9只（37.5%），第三组7只（29.2%），第四组2只（8.3%），五组瘤兔生存差异均有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

肝癌是常见的恶性肿瘤，其发病原因和机制尚不十分明确，至今仍然使用传统的手术治疗、放疗和化疗等手段治疗肝癌，特别是中晚期患者疗效不是特别满意。经过研究人们逐渐认识到肿瘤的生长和转移与血管的生长有着密切的关系，肿瘤基因治疗是目前研究的热点，关键是寻找目的基因和探索多基因联合治疗，以获得最佳的治疗效果。肿瘤免疫学认为恶性肿瘤是恶性转化细胞逃避了机体的免疫监视而快速的生长，而免疫逃逸的机制十分复杂，与机体的免疫功能、肿瘤细胞的抗原调变等均有很大关系[5]。机体免疫监视涉及特异性免疫、非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫等多种免疫成分，相互协作杀伤肿瘤细胞。一般认为抗肿瘤免疫的主要方式是细胞免疫，特异性效应细胞是T细胞，但是在发挥杀伤肿瘤细胞时会受到肿瘤细胞MHC限制。自杀基因是目前研究的热点，双自杀基因疗法通过整合两种自杀基因并转导入肿瘤细胞并表达融合基因产物，此产物具有两种自杀基因编码的酶活性，在此基础上进行双前体药物治疗可以发挥双功能的杀伤作用，使肿瘤对于两种双前体的药物更加敏感，具有高效、安全、广谱、不易出现耐药的优势[6-9]。在众多自杀基因的体系中，对TK基因和CD基因的研究较为深入并且取得了确切的效果，而TK、CD上自杀基因的融合在更安全、更高效、更广谱、不易产生耐药性的同时可以减少药物的剂量。双自杀基因最为突出的特点为“旁观者效应”，明显扩大了杀伤作用，克服了转导率低的缺点，效应更为强大，发挥出更大的抑癌效果。P53基因分为两种类型（突变型和野生型），大部分肝癌患者存在基因突变，突变型丧失了抑癌活性转为原癌基因，因此P53缺失或失活可导致化疗敏感性降低和耐药性出现，野生型主要是参与细胞内的DNA修复和诱导细胞凋亡，提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[10]。在应用基因治疗时，首先转染的基因应该具有一定的表达效率，其次要注意为了方便最大限度的杀伤肿瘤细胞导入的基因要局限于靶细胞，而不会损伤正常的细胞[11-12]。因此，基因治疗的关键就为提高靶向转染的效率和解决靶向性基因转移技术[13]。通过接入的方式直接将基因导入肿瘤组织还能够减轻毒副作用，降低对正常肝细胞的转染，可以作为基因治疗的理想给药方法及途径[14]。endprint

本研究结果显示，各治疗组肿瘤体积增长率均较对照组明显下降，其中第四组肿瘤增长率抑制最為有效，差异均有统计学意义（P<0.05），对照组瘤兔介入术后20～40 d相继全部死亡，治疗组在观察期内自然死亡30只（31.3%），第一组12只（50.0%），第二组9只（37.5%），第三组7只（29.2%），第四组2只（8.3%），五组瘤兔生存差异均有统计学意义（P<0.05）。本研究引入野生型P53基因发挥出正常抑癌功能的同时也加强了双自杀基因的效能，基因治疗与碘油栓塞相结合加剧了肿瘤内部缺氧的环境，延长基因治疗的作用，从而抑制肿瘤的生长达到延长生存期的效果[15]。介入技术是一种易操作的、微创的、理想的基因施放方法，导管应该能够将携带目的基因的载体投放到准确的部位，基因的转染仅限于所在的细胞内，最大限度的减少随血流流入远端部位而减轻基因治疗的不良反应[16-17]。介入医学的飞速发展在许多疾病的诊断和治疗中都占据着重要的作用，因此需要介入放射医生对基本原理和治疗的策略熟悉掌握，积极的投身基因治疗的临床试验中[18]。无论是肿瘤内灌注还是影像引导下的瘤内直接注射都是介入医学范畴，因此可见介入医学是基因导入的理想方法，并伴随肝癌的基因治疗逐步应用于临床并起到积极作用[19]。通过前期的研究已经证实了P53基因和TK、CD双自杀基因在肿瘤细胞内的转染和表达的情况，基因疗法主要通过静脉给药和瘤体内注射，相应的表达说明介入途径导入基因有效可行，为理想的给药方法和途径[20]。

综上所述，介入多疗法、多基因联合治疗能够克服介入治疗的副作用，有效地抑制肿瘤的生长，延长瘤兔的生存时间。

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（收稿日期：2017-04-25） （本文编辑：邓朝阳）endprint