COPD患者外周血中性粒细胞表面PSGL-1、CD44的表达以及香烟烟雾提取物对其表达的影响*

黄 宏， 王如娟， 朱慧芬， 杨道锋

华中科技大学同济医学院附属同济医院 1呼吸与危重症医学科 3感染科，武汉 430030 2华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系，武汉 430030

临床研究

COPD患者外周血中性粒细胞表面PSGL-1、CD44的表达以及香烟烟雾提取物对其表达的影响*

黄 宏1， 王如娟1， 朱慧芬2， 杨道锋3△

华中科技大学同济医学院附属同济医院1呼吸与危重症医学科3感染科，武汉 4300302华中科技大学同济医学院基础医学院免疫学系，武汉 430030

目的探讨P-选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1)和CD44在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者外周血中性粒细胞中的表达，以及香烟烟雾提取物对健康志愿者外周血中性粒细胞PSGL-1和CD44表达的影响。方法收集华中科技大学同济医学院附属同济医院2015年9月至2015年12月呼吸与危重症医学科收治的26例COPD患者(COPD组)，以及24例无吸烟史的健康志愿者作为正常对照组(NC组)，流式细胞术检测COPD患者和健康志愿者外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达。同时分离6例健康无吸烟史的志愿者外周血标本中的中性粒细胞，用不同浓度(0%、5%、10%、20%)香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)刺激，流式细胞术检测中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达。结果COPD组患者外周血中性粒细胞表面PSGL-1、CD44的表达较NC组明显增强(均P<0.05)，CSE刺激的正常人外周血中性粒细胞表面PSGL-1、CD44表达明显增强(均P<0.05)，且呈浓度依赖性。结论COPD患者外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达较正常对照组增强。香烟烟雾提取物可能通过促进外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达，从而启动中性粒细胞的粘附级联反应，促进气道中性粒细胞炎症反应。

慢性阻塞性肺疾病； 香烟烟雾提取物； P-选择素糖蛋白配体1； CD44

众所周知，吸烟引发的炎症反应是促使慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)发生发展的重要因素。吸烟诱导气道炎性细胞增多，特别是气道中性粒细胞的积聚和浸润。目前的研究已经证实中性粒细胞介导的气道炎症反应是COPD的重要致病因素。气道中性粒细胞的募集是使该细胞发生下游效应的关键环节之一。但是，气道中性粒细胞聚集和趋化的具体机制尚不完全清楚，厘清吸烟诱导的中性粒细胞气道募集的机制，不但有助于更加深入理解COPD的发病机制，也有助于COPD的有效治疗。

选择素家族包括P-选择素，L-选择素和E-选择素，对于白细胞、血小板和血管内皮细胞之间的粘附起着重要作用。P-选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1)几乎表达于所有白细胞表面，在炎症的早期，PSGL-1与活化的内皮细胞或血小板上的P-选择素相互作用，捕获血管内的白细胞。CD44是重要的细胞粘附分子，在炎症细胞的募集和信号介导等环节中发挥着重要作用。有研究发现吸烟者外周血可溶性CD44的表达明显增强[1]。本实验通过检测COPD患者和健康志愿者外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达，同时用不同浓度香烟烟雾提取物(CSE)刺激正常人外周血中性粒细胞，检测其表面PSGL-1和CD44的表达，探讨PSGL-1和CD44在COPD患者外周血中性粒细胞表面的表达，以及CSE对外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44表达的影响。

1 材料和方法

1.1 临床资料

选取华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科2015年9月至2015年12月收治的26例COPD急性发作期患者，其中男性18例，女性8例，年龄49～75岁，平均64岁。入选患者均符合慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)2011修订版诊断标准。24例健康志愿者作为正常对照组(NC组)，其中男性14例，女性10例，年龄18～68岁，平均52岁。同时，留取6例无吸烟史的健康志愿者血标本，其中男性3例，女性3例，年龄22～46岁，平均34岁。志愿者血标本留待中性粒细胞分离以及CSE刺激体外实验。

1.2 标本的收集和检测

取COPD患者或正常对照者外周血100 μL，加入PE标记的抗人PSGL-1抗体(美国BD公司)20 μL，4℃孵育30 min，加4 mL红细胞裂解液室温裂解8 min，离心1 000 r/min×5 min，去上清，PBS离心洗涤细胞2次，1 000 r/min×5 min，去上清，300 μL PBS重悬，用流式细胞仪(FACSCalibur流式细胞仪，美国BD公司)检测中性粒细胞PSGL-1平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)。取COPD患者或正常对照组外周血100 μL，加入PE标记的抗人CD44抗体(美国BD公司)20 μL，流式细胞术检测中性粒细胞CD44的MFI。

1.3 CSE制备

参照Nakamura等[2]的方法制备CSE。取2支去过滤嘴香烟(红金龙牌，武汉卷烟厂，含烟碱1.1 mg、焦油15 mg)，由负压驱动装置连续抽吸燃烧，10 min内燃烧完全。吸入的烟雾经由另一出口溶于50 mL RPMI-1640培养液，摇晃使其完全溶解。所制成的悬液密闭摇匀之后用NaOH调节pH值至7.40，再经0.22 μm微孔滤器过滤除菌，即制作成CSE原液，30 min内用于实验。

1.4 中性粒细胞分离

取健康志愿者外周血，采用淋巴细胞分层液分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，去除PBMC、分离液和血浆。红细胞和粒细胞用2 mL PBS重悬，加入等体积的6%Dextran T500混匀，静置20 min后，吸取上层白细胞至另一干净离心管中，离心1 200 r/min×5 min，去上清。再加入10 mL红细胞裂解液，室温裂解8 min，离心1 000 r/min×5 min，去上清后，用PBS洗涤细胞2次。

1.5 不同浓度CSE刺激后人外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达

分离后的中性粒细胞，用10%胎牛血清RPMI-1640培养液调整细胞浓度为3×106/mL，加入96孔板中200 μL /孔。再分别加入不同浓度(0%、5%、10%、20%)CSE，37℃培养16 h。流式管中分别加入PE标记的抗PSGL-1或者CD44抗体各20 μL，再分别加入培养后的中性粒细胞100 μL，4℃孵育30 min，用PBS洗涤细胞2次，加入300 μL PBS后，用流式细胞仪检测PSGL-1和CD44的MFI。

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0对实验数据进行处理，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 COPD组和正常对照组外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达

由图1可见COPD组(n=26)和正常对照组(n=24)外周血中性粒细胞表面PSGL-1的MFI分别是：(555.80±25.18)、(445.00±20.05)。CD44的MFI分别是：(524.70±22.52)、(409.00±30.22)。COPD组比对照组表达均明显增强，差异有统计学意义(均P<0.05)。

与NC组比较，*P<0.05图1 两组外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达Fig.1 The expression of PSGL-1 and CD44 on nutrophils between the COPD group and the control group

2.2 不同浓度CSE刺激健康志愿者外周血中性粒细胞表面PSGL-1、CD44的表达

由图2可见，无CSE刺激下的健康志愿者中性粒细胞PSGL-1和CD44的MFI分别是(318.00±6.17)、(387.00±14.17)；5%CSE刺激组PSGL-1和CD44的MFI分别(364.70±12.02)、(452.30±9.24)；10%CSE刺激组PSGL-1和CD44的MFI分别是(433.00±12.50)、(508.30±13.86)；20%CSE刺激组PSGL-1和CD44的MFI分别是(515.00±9.54)、(769.30±18.77)。CSE刺激组和无CSE刺激组比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。5%CSE组和10%CSE组PSGL-1和CD44表达的比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。10%CSE组和20%CSE组PSGL-1和CD44表达的比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

与无CSE组比较，*P<0.05；与5%CSE组比较，#P<0.05；与10%CSE组比较，△P<0.05图2 不同浓度CSE刺激的健康志愿者外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达Fig.2 Expression of PSGL-1 and CD44 on neutrophils stimulated with CSE of different concentrations in healthy volunteers

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持续性气流受限为特征的肺部疾病，与气道及肺组织对香烟烟雾等有害气体或其他有害颗粒的异常慢性炎症反应有关，是严重危害居民身体健康的慢性呼吸系统疾病。COPD患病人数多，死亡率高，给社会经济带来沉重负担。因此，COPD的防治一直都是呼吸系统疾病研究领域中的重要课题。

COPD的慢性炎症以中性粒细胞浸润为主要特征之一，长期吸烟是COPD最常见的致病因素。香烟烟雾含有多种毒性成分和自由基，血管内皮细胞在香烟烟雾刺激下可使多种炎性因子的表达增强，促进中性粒细胞在炎症部位的迁移、聚集和活化[3-6]。有报道称吸烟的COPD患者较非吸烟的COPD患者肺功能下降更明显，且病死率更高[7]。本实验通过比较COPD患者和正常人外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达，并且比较不同浓度香烟烟雾提取物刺激对正常人外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44表达的影响，初步探讨PSGL-1和CD44在吸烟诱导的COPD患者气道中性粒细胞募集中的作用。

在静息状态下，只有低于2%的中性粒细胞释放到外周血。而在炎症刺激下，循环血中的中性粒细胞数量快速增长至正常状态下的10倍以上，并在数分钟内募集到炎症部位持续数小时之久。中性粒细胞从血液中被募集到炎症部位发挥生物学效应，这个过程受到表达于中性粒细胞和血管内皮细胞表面的各种粘附分子的调控。炎症刺激下，血管内皮细胞中的Weibel-Palade小体的膜与内皮细胞胞膜融合，导致P-选择素外化；E-选择素则通过转录合成，高表达于血管内皮细胞表面；L-选择素从白细胞表面转化成可溶性具有活性的形式脱落入血。这3种形式的选择素均能与中性粒细胞表面的PSGL-1结合，从而启动血管内皮对中性粒细胞的捕获[8]。PSGL-1是上世纪90年代初发现的一种粘附分子，具有同源二聚体结构的跨膜糖蛋白，表达在几乎所有的白细胞和一些活化的内皮细胞表面。炎症刺激使PSGL-1发生了高度唾液酸化的修饰，PSGL-1分子向外延伸，更容易与选择素相互作用，捕获循环血中的白细胞，完成白细胞的起始粘附。可见，PSGL-1是中性粒细胞粘附级联主要的起始因子之一。我们研究发现，COPD患者外周血中性粒细胞PSGL-1的表达强度明显高于正常人，CSE刺激的正常人外周血中性粒细胞表面PSGL-1表达明显增强，且呈浓度依赖性。因此，我们推测香烟烟雾提取物可能通过增强外周血中性粒细胞表面PSGL-1的表达启动了中性粒细胞在血管内皮上的粘附级联反应，促进COPD气道中性粒细胞的募集。

炎症反应状况下，中性粒细胞不仅被血管内皮细胞捕获，而且中性粒细胞在血管内皮上滚动的速度明显减慢(慢滚动)。CD44是重要的细胞粘附分子，广泛分布于多种细胞表面，参与炎症反应、组织发育、创伤修复等多种病理生理过程。内皮源性的E-选择素与中性粒细胞表面的配体CD44结合后，使中性粒细胞表面的PSGL-1和L-选择素重新分布，加强了对循环血中中性粒细胞的第二次捕获[9]。我们前期的研究发现，香烟烟雾提取物刺激血管内皮细胞E-选择素高表达(结果未提供)。本实验中我们亦发现，COPD患者外周血中性粒细胞表面CD44的表达明显高于正常人，CSE刺激的正常人外周血中性粒细胞表面CD44表达亦明显增强，且呈浓度依赖性。因此，我们推测香烟烟雾提取物可能通过激活外周血中性粒细胞表面CD44和血管内皮细胞E-选择素的表达，参与中性粒细胞的再次捕获和慢滚动，进一步促进COPD气道中性粒细胞炎症反应。

综上所述，我们认为COPD患者外周血中性粒细胞表面PSGL-1和CD44的表达明显升高。而香烟烟雾提取物可能通过激活外周血中性粒细胞表面PSGL-1、CD44，从而启动中性粒细胞粘附级联反应促进气道中性粒细胞炎症反应。

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ExpressionofPSGL-1andCD44onPeripheralNeutrophilsinCOPDPatientsandEffectofCigaretteSmokeExtractonTheirExpression

Huang Hong1，Wang Rujuan1，Zhu Huifen2et al

1DepartmentofRespiratoryDiseasesandCriticalCareMedicine，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofImmunology，SchoolofBasicMedicine，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

ObjectiveTo investigate the expression of P-selectin glycoprotein ligand 1(PSGL-1)and CD44 on neutrophils in chronic obstructive pulmonary disease(COPD)patients and the effect of cigarette smoke extract(CSE)on their expression.MethodsA total of 26 COPD patients hospitalized in the Department of Respiratory Diseases and Critical Care Medicine in Tongji Hospital from September 2015 to December 2015，and 24 healthy controls were enrolled in this study.The expression of PSGL-1 and CD44 on neutrophils in COPD patients and healthy controls were detected by flow cytometry.In addition，peripheral neutrophils were separated from 6 healthy non-smokers volunteers and stimulated with cigarette smoke extract(CSE)at various concentrations(0%，5%，10% and 20%).The expression of PSGL-1 and CD44 on neutrophils was detected by flow cytometry.ResultsThe expression of PSGL-1 and CD44 on neutrophils significantly increased in COPD patients in comparison to healthy controls(bothP<0.05).The expression of PSGL-1 and CD44 on neutrophils significantly increased with CSE stimulation(bothP<0.05)，and it was concentration-dependent.ConclusionThe expression levels of PSGL-1 and CD44 are significantly increased in COPD patients.CSE increases their expression on neutrophils in human peripheral blood，thus may initiate adhesion cascade reaction of neutrophils，and promotes the neutrophil recruitment in the airway of COPD patients.

COPD； cigarette smoke extract； P-selectin glycoprotein ligand 1； CD44

*湖北省自然科学基金资助项目(No.2017CFB765)

黄 宏，女，1967年生，副教授，副主任医师，E-mail：huanghong@tjh.tjmu.edu.cn

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：yangdaofeng@aliyun.com

R563

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.05.016

(2016-04-01 收稿)