急性肝衰竭肺部感染短帚霉的病原特征研究

张鞠玲，袁 媛，王 欢，鲍春梅，曲 芬

急性肝衰竭肺部感染短帚霉的病原特征研究

张鞠玲，袁 媛，王 欢，鲍春梅，曲 芬

目的探讨急性肝衰竭患者肺部感染短帚霉的实验诊断特征，为临床诊治该菌感染提供科学依据。方法2017年1月收集1例药物性肝损伤导致急性肝衰竭并肺部感染短帚霉患者，对其标本进行痰真菌培养，通过观察菌落生长形态和光学显微镜下菌株形态，质谱仪检测及扩增ITS序列对其进行鉴定确诊；采用E-test方法进行真菌体外药物敏感性（药敏）试验。结果结合不同温度、不同培养基下真菌生长的形态学特征，质谱仪分析及rDNA-ITS序列分析确定为短帚霉，该株短帚霉对伏立康唑和两性霉素B有较好的敏感性，最小抑菌浓度值分别为≥0.50 μg/ml和≤0.75 μg/ml。结论 本例为急性肝衰竭患者肺部感染短帚霉的首例报道，短帚霉有其形态特征和药敏特点，临床应正确选用抗菌药物。

急性肝衰竭；短帚霉；肺部感染；诊断

短帚霉属于子囊菌门单囊壁菌纲，广泛存在于空气、土壤、食品、植物、纸以及木材中[1]，是一种腐生性条件致病真菌。通常认为该菌引起甲真菌病，较少引起其他部位的侵袭性感染。但目前国外已有关于深部组织感染的报道，如肺移植受体、心内膜炎、鼻窦炎等，且感染主要发生于免疫力低下患者[2-4]。短帚霉生长缓慢，传统方法不易直接鉴定到种属水平；感染早期影像学改变不明显，且容易被误诊为污染菌。本研究通过对短帚霉菌落形态和显微镜下形态特征、质谱检测、DNA测序和药物敏感性（药敏）试验进行系统研究，为实验室鉴定及临床明确诊断该菌感染提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 患者，女，48岁，2017年1月20日出现黄疸，意识障碍1 d，后以肝硬化合并急性肝衰竭入院。给予支持对症治疗效果欠佳。患者有药物性肝损伤病史，1月22日患者出现发热、咳嗽等呼吸道症状，血常规示白细胞总数为（8.19～10.11）×109/L，中性粒细胞比例为72.40%～88.10%，降钙素原为0.476～1.350 ng/ml，G实验为31.9 pg/ml，GM实验为0.47。肺部听诊呼吸音粗，双肺可闻及湿啰音，肺部CT示双侧胸腔积液伴左侧局限性肺不张。1月23日患者氧饱和度不能维持，改用无创呼吸机辅助呼吸，高热持续，患者总体病情无好转。1月26日连续床旁纤维支气管镜采集肺部支气管肺泡灌洗液及痰标本行病原学检测的同时，进行抗感染、保肝、维持水及电解质平衡，维持心肺功能的综合抢救措施。患者多脏器功能持续恶化，患者家属放弃治疗，于1月28日出院。出院后于2月2日连续3次培养结果均为短帚霉。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 主要为沙保弱（SDA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、真菌Mueller-Hinton（OXOID公司，英国），乳酸酚棉蓝染液（珠海贝索生物技术有限公司），组分Ⅰ、Ⅱ（北京毅新博创生物科技有限公司)，ITS1、 ITS4（华大基因），Premix Taq Version2.0（TaKaRa，日本），玻璃珠法柱式真菌DNAout（北京天恩泽基因科技有限公司），50×TAE（北京索莱宝科技有限公司），1.5 ml离心管（Axygen，美国），PCR管（Axygen，美国），药敏E-test法（郑州安图生物工程股份有限公司）。

1.2.2 仪器 主要有光学显微镜（OLYMPUS-CH，日本），质谱仪Clin-TOF MS（北京毅新博创生物科技有限公司），临床微生物菌种鉴定数据库BioExplorerV2.3（北京毅新博创生物科技有限公司），电热恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），霉菌培养箱（杭州雪中炭恒温技术有限公司），高速离心机（Thermo，美国），PCR仪（BIO-RAD，美国）、电泳仪、凝胶成像系统（BIO-RAD，美国）。

1.3 方法

1.3.1 菌种分离培养、形态学鉴定 连续多次采集痰液，进行病原学检测。痰标本直接接种于SDA、PDA培养皿，分别进行27 ℃和37 ℃培养14 d，连续观察菌落变化。光镜下形态学观察，用方块法小培养，培养基为PDA，27 ℃培养72 h，用透明胶带粘取丝状真菌表面，置于滴有乳酸棉蓝染液的玻片上，在光学显微镜下观察孢子、菌丝和分生孢子形态、生长方式及菌丝特征等[5]。

1.3.2 质谱仪鉴定

1.3.2.1 质谱仪检测 根据质谱仪Clin-TOF MS使用说明，采用直接涂抹法鉴定致病真菌。挑取真菌菌落均匀涂抹在靶板上自然干燥，在样品点上覆盖1 μl组分Ⅰ自然干燥，再覆盖1 μl基质液（α-氰基-4-羟基肉桂酸）自然干燥，上机检测。质控菌株采用ATCC8739（大肠埃希菌）。使用Clin-TOF MS采集图谱，在线性模式下设置如下参数：激光频率40 Hz、加速电压20 kV、脉冲电压2 kV、离子透镜电压6 kV、相对分子质量范围2000～20 000 Da，将质谱图导入BioExplorer2.0软件搜库，生成鉴定报告[6]。

1.3.2.2 结果判定 Clin-TOF质谱系统鉴定分值≥25.00为鉴定结果可信；分值在20.00～24.99之间建议重新检测或补充实验帮助鉴定；分值＜20.00为结果不可信。

1.3.3 分子生物学鉴定

1.3.3.1 DNA模板制备 真菌菌株按照玻璃珠法柱式真菌DNAout试剂盒说明书操作方法提取真菌DNA模板，制备的核酸于-20 ℃保存备用。

1.3.3.2 PCR扩增 实验室采用真菌通用引物，参照Lott等[7]报 道。ITS1（F）：5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´；ITS4（R）：5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´。 扩 增 真 菌核糖体转录间隔区。PCR反应体系50 μl，参照Premix试剂说明书配置。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察是否有条带。

1.3.3.3 测序及序列分析 将扩增片段的PCR产物送华大基因科技公司进行测序。在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）应用Blastn对基因序列进行同源性分析。

1.3.4 药敏试验 采用E-test条对致病菌进行伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B体外真菌药敏试验。药敏试验严格按照《全国临床检验操作规程》进行。药敏结果依据美国临床实验室标准化协会 M27-S4进行判读。

2 结 果

2.1 菌落形态及镜下特征 短帚霉菌落在3 d后呈白色膜样菌落，10 d以后呈深褐色、灰褐色粉末状，菌落边缘为淡黄色，背面为黄褐色。27 ℃SDA培养菌落表面呈绳状。37 ℃ PDA培养菌落表面褶皱明显（见图1）。乳酸棉蓝染色镜检发现分生孢子梗自菌丝长出，极短或无分生孢子梗。子实结构不规则，有的仅菌丝上产生无柄的单个环痕子梗。有的具有明显的帚状枝，外观似青霉。分生孢子由环孢子梗产生，呈球形或柠檬形，壁厚，粗糙有刺，有的成熟的分生孢子脱落在菌丝周围，孢子较大，直径可达10 μm（见图2）。

2.2 质谱仪检测结果 质谱仪检测显示主要有8个主峰，强度最大的峰为7808，该峰强度为582 mV。质谱仪检测评分为42，鉴定结果可信，鉴定结果及峰图见图3。

2.3 DNA序列分析 测序结果和基因Bank比对，符合率为98%，鉴定为短帚霉。基因序列见图4。

2.4 药敏结果 该株短帚霉对伏立康唑和两性霉素B有较好的敏感性。伏立康唑，最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC） ≤ 0.50 μg/ml， 两 性 霉素B，MIC ≤ 0.75 μg/ml。对伊曲康唑耐药，MIC ≥ 32.00 μg/ml（见表 1）。

3 讨 论

图1 短帚霉菌落形态A. 3 d（27 ℃ SDA）；B. 14 d（27 ℃ SDA）；C. 3 d（27 ℃ PDA）；D. 14 d（27 ℃ PDA）； E. 3 d（37 ℃ PDA）；F. 14 d（37 ℃PDA）；G. 3 d（37 ℃ SDA）；H. 14 d（37 ℃ SDA）Figure 1 Colonial morphology of Scopulariopsis brevicaulis

图2 短帚霉乳酸棉蓝染色光学显微镜下形态I. 放大倍数 10×； J. 放大倍数 40×Figure 2 Morphology of Scopulariopsis brevicaulis under optical microscope by lactic acid cotton blue staining

图3 短帚霉质谱鉴定谱图Figure 3 Spectrogram of Scopulariopsis brevicaulis by Clin-TOF MS identification

侵入性霉菌感染已经成为临床抗感染治疗的棘手问题，早期、快速、准确的诊断是临床及时救治的关键[8]。帚霉也可引起侵入性霉菌感染，多从呼吸道、表皮组织、深层组织或流体样本中获得。临床上最常见的是短帚霉，本实验中分离的菌种经基因测序为短帚霉。以往文献中有帚霉引起心内膜炎、鼻窦炎、脑脓肿、深部皮肤感染、器官移植术后感染、白血病患者肺部感染并传播的相关报道[9-14]，但急性肝衰竭患者肺部短帚霉感染的病例未见报道。

图4 短帚霉基因比对结果Figure 4 Gene comparison results of Scopulariopsis brevicaulis

表1 短帚霉药敏结果Table 1 Results of Scopulariopsis brevicaulis drug susceptibility

实验室常采用观察平板菌落特点和镜下真菌形态、产孢方式相结合的方法来鉴定丝状真菌。但真菌菌落形态易受培养平板、培养温度等影响，易产生人为误差。本研究的短帚霉分别在PDA、SDA 27 ℃和37 ℃培养下，生长形态不同。因此，辨识菌落形态须要充分了解丝状真菌在不同培养基和不同温度下的形态特征。分子生物学方法是“金标准”，能够成功准确鉴定短帚霉。质谱技术是近年来的研究热点，以高通量、快速、准确等优点受到微生物实验室的广泛关注。对酵母真菌达到属水平的鉴定率为98.68%，对丝状真菌达到属水平的鉴定率为96.74%[15]，鉴定短帚霉的分值在种水平的可信度以上。本研究通过对多种鉴定方法的比较，表明质谱鉴定的速度快、准确度高，有助于临床早期诊断致病性真菌。

目前临床没有治疗帚霉感染药敏的相关规范，且短帚霉对多种常用治疗真菌的药物都具有较强的耐药性。本文中的短帚霉仅对伏立康唑，两性霉素B有较好的敏感性。有研究显示泊沙康唑加特比萘芬，两性霉素B加卡泊芬净联合用药中观察到协同作用[16]。还有学者提出使用泊沙康唑、特比萘芬和卡泊芬净3种药物联合治疗帚霉有较好的效果[17]。早期诊断对选择治疗药物至关重要，由于丝状真菌生长缓慢的特性，传统的鉴定方法限制了早期诊断，随着质谱仪和基因测序技术在临床上的广泛应用，不断认识真菌的实验室特征并开发新的检测技术是未来研究的方向。

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Pathogen characteristics of Scopulariopsis brevicaulis in acute hepatic failure patients with pulmonary infection

ZHANG Ju-ling, YUAN Yuan, WANG Huan, BAO Chun-mei, QU Fen*
Center of Clinical Laboratory, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

ObjectiveTo investigate the laboratory diagnostic characteristics of Scopulariopsis brevicaulis in a acute hepatic failure patient with pulmonary infection, and provide scientific evidence for clinical diagnosis and treatment .MethodsThe sputum specimen was collected from a patient with acute hepatic failure caused by medicamentous liver lesion and cultivated for fungal in January 2017.The fungi was identified by observing the morphology of colony growth under microscope and confirmed by mass spectrometer and the amplification of ITS sequence. The drug sensitivity test in vitro of fungi was performed with E-test method.ResultsScopulariopsis brevicaulis was diagnosed according to the morphology of fungi growth in different temperatures and media, mass spectrometer detection and rDNA-ITS sequence analysis. It was sensitive to volconazole and amphotericin B, with minimal inhibitory concentration values of ≥ 0.50 μg/ml and ≤ 0.75 μg/ml respectively.ConclusionsIt is the first report of pulmonary infection patients with acute hepatic failure caused by Scopulariopsis brevicaulis. It has morphological characteristics and drug sensitivity.Therefore, antibacterial agents should be selected correctly for clinical treatment.

acute hepatic failure; Scopulariopsis brevicaulis; pulmonary infection; diagnosis

R379

A

1007-8134(2017)05-0272-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.05.007

首都市民健康培育项目（Z151100003915151）

100039 北京，解放军第三○二医院临床检验医学中心（张鞠玲、袁媛、王欢、 鲍春梅、曲芬）

曲芬， E-mail： qf302@163.com

*Corresponding author, E-mail: qf302@163.com

（2017-09-05收稿 2017-09-28修回）

（本文编辑 胡 玫）