超敏蛋白BaPE1对烟草马铃薯Y病毒的诱导抗性

王 颖，付 强，陈雅寒，成巨龙，安德荣

(1.西北农林科技大学 植物保护学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100；2.陕西省烟草公司 烟草研究所，西安 710061)

超敏蛋白BaPE1对烟草马铃薯Y病毒的诱导抗性

王 颖1，付 强1，陈雅寒1，成巨龙2，安德荣1

(1.西北农林科技大学 植物保护学院，旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100；2.陕西省烟草公司 烟草研究所，西安 710061)

为了探究超敏蛋白对烟草马铃薯Y病毒病的诱导抗性影响，采用半叶枯斑法和田间效果试验研究超敏蛋白BaPE1提取物对枯斑三生烟和普通烟的诱导抗性和促生作用。结果表明，超敏蛋白BaPE1能诱导烟株对烟草马铃薯Y病毒产生抗性，并对烟草有一定的促生作用。接种前48 h喷施500 μg/mL超敏蛋白BaPE1预防效果达70.46%，接种后24 h、48 h喷施500 μg/mL超敏蛋白BaPE1治疗效果达61.30%和60.59%,均显著高于对照组；喷施500 μg/mL超敏蛋白后烟草在株高、茎围、最大叶面积等方面表现出较好的生长势，并高于其他处理。因此，超敏蛋白BaPE1不仅可以提高烟草抗性而且还能促进烟株生长、提高烟叶经济效益。

超敏蛋白；烟草马铃薯Y病毒；抗性；促生

烟草马铃薯Y病毒病是由马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的系统性病害，主要通过烟蚜介体传播[1]。该病毒一般与烟草花叶病毒以及黄瓜花叶病毒等混合侵染，引起烟株花叶、斑驳、矮化、畸形、脉带坏死等症状，严重影响烟叶的质量与产量，造成巨大的经济损失[2]。目前，对于烟草病害的防治主要以化学农药和使用抗病品种为主，成效甚微，且化学农药的不合理使用造成的环境污染、农药残留以及抗药性增加等问题日渐严重。生物防治作为符合现代农业可持续发展战略的防治手段，得到越来越多人的关注。

1992年首次从梨火疫病原菌(Erwiniaamylovory)中分离得到超敏蛋白，之后国内外研究学者不断从多种病原细菌中分离出具有相似功能的蛋白激发子[3-5]。超敏蛋白BaPE1是由解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba-168菌株产生的非特异性蛋白因子，属于新型激活蛋白，具有诱导植物产生非寄主抗性和一定的促生作用[6-7]。本研究采用由解淀粉芽孢杆菌Ba-168菌株通过发酵得到的超敏蛋白BaPE1对烟草马铃薯Y病毒的诱导抗性进行研究，希望能够为烟草病害防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料、供试菌株及相关培养基

烟草：心叶烟(Nitcotianaglutinosa)、普通烟 NC89(Nitcotianatobacumvar.NC89)，分别由中国农科院烟草研究所和陕西省烟草研究所提供。

菌株：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Ba-168菌株，由西北农林科技大学植物病毒和资源微生物实验室前工作者分离、鉴定并保藏。

供试病毒：烟草马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)，由西北农林科技大学植物保护学院植物病毒实验室分离保存于(25±3) ℃防虫温室中普通烟草上。

试剂及仪器：w=20%吗啉胍·乙铜(moroxydine hydrochloride-copper acetate，MCA)可湿性粉剂，青岛瀚正益农生物科技有限公司；φ=8%宁南霉素(ningnanmycin)水剂，黑龙江强尔生化技术开发有限公司；手持式喷雾器，浙江广丰塑业有限公司。

发酵用的培养基为Luria-Bertani培养基(LB)：酵母粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、H2O 1 000 mL、pH 7.2。

1.2 超敏蛋白BaPE1的制备

将解淀粉芽孢杆菌Ba-168菌株接种于LB平板上进行活化，28 ℃恒温培养箱培养24 h。挑取适量菌株接种于50 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min发酵培养72 h，从而制得超敏蛋白BaPE1发酵液。

将发酵液经4 ℃、10 000 r/min离心12 min后，将收集到的上清液通过0.45 μm的滤膜抽滤3～4次直至完全去除菌体，从而得到超敏蛋白BaPE1原液。

1.3 超敏蛋白BaPE1诱导心叶烟抗PVY作用

该部分包括预防试验和治疗试验两部分。预防试验和治疗试验均采用半叶枯斑法测定，都选择6～7叶期长势一致的心叶烟，打顶后留3～4片叶，置于22～30 ℃温室内自然光照培养1周，这两部分试验都选择w=20%吗啉胍·乙铜可湿性粉剂和φ=8%宁南霉素水剂800倍液为对照药剂。不同的是，预防试验是将500倍稀释处理的超敏蛋白BaPE1和800倍稀释处理的w=20%吗啉胍·乙铜可湿性粉剂以及φ=8%宁南霉素水剂后采用喷雾法喷施到烟叶半叶，另半叶喷清水处理。于喷施处理24 、48 h后，对处理过的烟叶进行全叶片摩擦接种PVY。而治疗效果是先将烟叶进行全叶片摩擦接种，保湿24 h、48 h后，分别将经过800倍稀释处理的超敏蛋白BaPE1、w=20%吗啉胍·乙铜可湿性粉剂和φ=8%宁南霉素水剂喷施到接种的烟叶半叶，另外半叶采用清水处理。其他条件一致，每处理3株，每株处理3片叶，重复3次，之后置于22～30 ℃温室内自然光照培养，7 d后统计枯斑数并计算预防效果和治疗效果。

预防效果=(处理半叶枯斑数-对照半叶枯斑数)/对照半叶枯斑数×100%。

治疗效果=(处理半叶枯斑数-对照半叶枯斑数)/对照半叶枯斑数×100%。

1.4 超敏蛋白BaPE1对烟草促生效果

于2015年陕西汉中西乡县试验田进行，试验分4个处理(超敏蛋白BaPE1，20%吗啉胍·乙铜可湿性粉剂，8%宁南霉素水剂和CK)，每处理3个小区，每个小区25 m2，大田面积667 m2，栽培行株距为120 cm×50 cm，每个小区种植不少于40株。在普通烟NC89的烟草苗床期进行喷药处理，每次喷药间隔20 d，共喷洒3次，3组处理均稀释至800倍，快速均匀喷施于烟草茎叶上，各组喷施处理液以叶片上的溶液开始下滴为度。施药时，小区间用塑料膜遮隔，以防小区间药剂相互干扰。喷药后于打顶后期对普通烟NC89的株高、茎围、有效叶数、最大叶长和叶宽进行观察。

1.5 数据分析

试验数据采用SPSS 16.0软件进行处理，采用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 超敏蛋白BaPE1诱导心叶烟抗PVY作用

试验结果显示，超敏蛋白BaPE1对于PVY具有较好的预防效果和一定的治疗效果。相比于两组药剂对照组的抑制率，超敏蛋白对PVY的预防和治疗效果具有明显优势。仅就超敏蛋白对PVY的预防效果来看，在接种前24、48 h喷施超敏蛋白BaPE1后的枯斑抑制率分别为53.01%和70.46%，说明越早喷施超敏蛋白BaPE1，对PVY的预防效果越好。从治疗效果来看，超敏蛋白BaPE1可以有效地控制烟草马铃薯Y病毒的扩展和危害，防治效果在60%左右。相较于其他药剂处理组的抑制率，超敏蛋白BaPE1的防治效果要好于药剂处理组，说明接毒后及时喷施超敏蛋白BaPE1，仍然能够提高烟草的抗性(表1、2)。

2.2 超敏蛋白BaPE1对烟草促生效果

小区促生调查结果显示(表3)，喷施超敏蛋白BaPE1后，在打顶期烟草的株高、茎围、最大叶面积均处于最高水平，且从高到低顺序为超敏蛋白BaPE1>20%吗啉胍·乙铜可湿性粉剂>8%宁南霉素水剂>空白对照。喷施超敏蛋白BaPE1的植株表现出明显的生长优势，且叶片宽大、颜色变深，与20%吗啉胍·乙铜可湿性粉剂相比，株高、茎围、最大叶面积分别提高15.09%、28.17%、9.47%。超敏蛋白BaPE1能够有效地促进烟草生长，具有良好的促生效果。

3 结论与讨论

本研究表明，经超敏蛋白BaPE1处理，可以有效控制PVY的扩展和对烟草的危害，诱导烟草对PVY产生抗性，并能够在一定程度上对烟草有促生作用。调整超敏蛋白的喷施时间可以将枯斑抑制率从61.30%提高到70.46%，且都要比药剂对照组的效果好，说明超敏蛋白能够显著提高烟草对PVY病毒的抗性。究其原因，可能是超敏蛋白BaPE1作为一种蛋白因子，通过激活植物自身免疫系统、生长系统等，从而达到提高植物抗性的效果[8-9]。一般药剂对烟草抗PVY效果不佳，可能是长期使用化学药剂导致植物产生的抗药性从而影响植物对PVY的抗性[10]。通过研究超敏蛋白对烟草生长的影响，结果表明相比对照组，喷施超敏蛋白后的植株普遍表现出茎秆粗壮、叶片肥厚、叶片颜色浓绿，表现出更为旺盛的生长势。对于喷施超敏蛋白所产生的促生作用，研究学者认为一方面是超敏蛋白作为蛋白因子本身所含有的氨基酸等物质直接作为植物生长所需营养成分；另一方面，超敏蛋白作为细菌发酵产物含有大量铁、锰、锌等营养元素，能够促进植物合成更多的叶绿素等物质从而直接影响植物的蛋白质合成以及光合作用等[11-13]。

表1 超敏蛋白BaPE1对PVY的预防效果Table 1 Preventing effect of BaPE1 on PVY

注：数据为“平均数±标准误”。同列数据后不同大、小写字母分别表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.01、P<0.05水平差异显著。下同。

Note:Data in the table are “mean±SE”.Different uppercase and lowercase letters in the same column indicate significant differences atP<0.01 andP<0.05 levels by Ducan’s new multiple test, respectively.The same below.

表2 超敏蛋白BaPE1对PVY的治疗效果Table 2 Treatment effect of BaPE1 on PVY

表3 超敏蛋白BaPE1对烟草农艺性状的影响Table 3 Effect of Harpin BaPE1 on NC-89 agronomic traits

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EffectsofHarpinBaPE1onPVY-resistantofTobacco

WANG Ying1,FU Qiang1,CHEN Yahan1,CHENG Julong2and AN Derong1

(1.State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, College of Plant Protection, Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China; 2.Tobacco Research of Shaanxi Province, Xi’an 710061,China)

In order to study effect of Harpin BaPE1 on induced-resistance on PVY, the half-leaf method and field experiment were selected to detect the anti-PVY activity and growth promoting effects of Harpin BaPE1 onNicotianatabacumvar.‘Samsun NN’ andN.tabacum.The results showed that the Harpin BaPE1 induced the tobacco got induced resistance and growth-promoting. Spraying 500 μg/mL Harpin 48 h before PVY inoculation, the prevention effect was up to 70.46%, and the treatment effect of 24 h,48 h after inoculation were 61.30% and 60.59%, and all the effects were significantly higher than the control. After spraying 500 μg/mL Harpin, the tobacco performed better growth potential in plant height, stem girth and area of maximum leaf, and higher than the other treatments. Therefore the Harpin BaPE1 not only could enhance the tobacco resistance of PVY, but also promote the growth.

Harpin BaPE1； PVY； Resistance； Growth-promoting

2016-09-26

2017-03-23

State Tobacco Monopoly Bureau“Aphidius Gifuensis Prevention and Control of Myzus Persicae Localization Technology Research and Extension”(No.KJ-2014-01).

WANG Ying, female,master student.Research area:plant pathology.E-mail:waktny@163.com

AN Derong,male,professor, Ph.D.Research area: plant pathology.E-mail:anderong323@163.com

S435.72

A

1004-1389(2017)10-1550-04

日期：2017-10-18

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171018.1733.038.html

2016-09-26

2017-03-23

陕西省烟草专卖局资助项目(KJ-2014-01)。

王 颖，女，硕士研究生，研究方向为植物病理。E-mail：waktny@163.com

安德荣，男，教授，从事植物病毒学研究。E-mail：anderong323@163.com

(责任编辑：郭柏寿Responsibleeditor:GUOBaishou)