LoxP-Cre重组技术在构建马铃薯光呼吸代谢支路中的应用

姚振

(长江大学园艺园林学院，湖北荆州434025 华南农业大学生命科学学院分子植物生理实验室，广东广州510640)

沈博然，彭新湘

(华南农业大学生命科学学院分子植物生理实验室，广东 广州 510640)

LoxP-Cre重组技术在构建马铃薯光呼吸代谢支路中的应用

姚振

(长江大学园艺园林学院，湖北荆州434025 华南农业大学生命科学学院分子植物生理实验室，广东广州510640)

沈博然，彭新湘

(华南农业大学生命科学学院分子植物生理实验室，广东 广州 510640)

利用LoxP-Cre同源重组原理，以表达盒堆积的方式组合光呼吸代谢支路改造基因AtGDH、EcGCL和EcTSR，成功构建了多基因转化载体pYL-GCL-GDH-TSR，通过根癌农杆菌侵染以及潮霉素筛选，获得了马铃薯转化植株。分子检测表明，转基因植株中3个目的基因在mRNA水平均能得到表达，但在蛋白水平无表达。转基因植株在表型和微型薯的发育上与野生型植株无明显区别，可能原因是由于多基因一次性转化与叶绿体定位的双重要求，增加了马铃薯遗传转化及蛋白有效表达的难度。

马铃薯；多基因转化；光呼吸

在C3植物中，通过构建光呼吸代谢支路以增加碳同化效率，从而提高生物量，这些支路包括Kebeish支路[1]、Maier支路[2]和Carvalho支路[3]。Nolke等[4]采用融合蛋白技术在马铃薯中表达的大肠杆菌GDH的3个亚基实质上仍是属于Kebeish支路。光呼吸代谢改造通常需要将2～4个基因引入叶绿体并协调表达。多基因转化可以采用组合转化、杂交、逐步转化、质体转化等技术，这些技术的使用受限于植物的遗传转化体系、繁殖方式、工作量以及植物生长周期等条件。

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄属一年生草本，其块茎可供食用，是重要的粮食、蔬菜和新兴的能源作物。马铃薯的人类可食用部分高达85%，相比之下谷类作物大约为50%，马铃薯富含碳水化合物，使其成为良好的热能来源。2011年，完成了马铃薯全基因组测序和分析[5]。破译马铃薯基因组序列，对于科学家们从分子水平上了解马铃薯的生长、发育及繁殖过程具有重要的意义。该项研究同时表明栽培种经历了多次淘汰选择，造成基因库狭窄。马铃薯的遗传转化一直是研究热点，多基因转化载体特别是光呼吸改造的多基因转化载体对马铃薯的遗传转化体系的影响具有很大的未知性。

在光呼吸代谢支路构建过程中，引入代谢乙醇酸的酶是关键步骤。细菌的乙醇酸脱氢酶含有D、E、F 3个亚基，由3个基因编码，在Kebeish等[1]和Nolke等[4]的研究中分别以二次转化和融合蛋白的方式表达了细菌的乙醇酸脱氢酶。Maier等[2]的研究中，在采用植物的乙醇酸氧化酶的同时，引入了细菌的过氧化氢酶以分解过氧化氢。有报道[6]指出，AtGDH(GI：30681516)编码拟南芥的D-乳糖脱氢酶，该酶同时具有乙醛酸脱氢酶的活性。

本研究利用华南农业大学刘耀光研究员提供的LoxP-Cre多基因组装系统构建多基因表达载体[7]，一次性将光呼吸改造需要的3个基因乳糖脱氢酶基因AtGDH、乙醛酸聚醛酶基因EcGCL(GI：49175990)和羟基丙二酸半醛还原酶基因EcTSR(GI：49175990)，以表达盒堆积(Cassette stacking)的方式导入马铃薯基因组，并对转基因植株的基因表达及表型进行分析。

1 材料与方法

1.1多基因转化载体的构建

多基因转化载体由2个供体载体pDonor1、pDonor2和1个受体载体pYL1305组成。供体质粒和受体质粒共转携带重组酶基因的NS3529菌株，挑选发生重组的受体质粒，基于LoxP-Cre重组的原理将目标基因的表达盒逐步添加到受体载体。大肠杆菌乙醛酸聚醛酶基因(EcGCL)和水稻rbcS叶绿体定位信号肽基因序列RTPC(141bp，编码47个氨基酸)连接直接连入pYL1305替换载体骨架的GUS基因；拟南芥乙醇酸脱氢酶基因(AtGDH)和RTPC连接到二元载体pOX(华南农业大学刘耀光研究员赠送、提供ubi启动子和终止子)，然后表达盒连入pDonor1；羟基丙二酸半醛还原酶基因(EcTSR)和RTPC连入载体pCactF(提供Actin启动子和终止子)，然后表达盒连入pDonor2。供受体质粒通过进行2轮重组构建目标载体pYL-GCL-GDH-TSR(图1)。

注：35S-HPT——35S启动子驱动的潮霉素抗性基因； 35S-GUS——35S启动子驱动的绿色荧光蛋白GUS；LoxP、1L、2L、1R、2R——重组位点；I-Sce I、PI-Sce I——归位内切酶识别位点；TSR——大肠杆菌羟基丙二酸半醛还原酶EcTSR；AtGDH——拟南芥乙醇酸脱氢酶AtGDH；GCL——大肠杆菌乙醛酸聚醛酶EcGCL。图1 多基因表达载体及目标载体质粒图谱

1.2马铃薯的试管薯诱导

转化品种为‘鄂马铃薯三号’，采用种薯建立无菌体系。试管苗茎段培养20d后，苗高3～6cm时，将试管苗再切段转至试管薯诱导培养基(MS培养基添加80g/L的蔗糖，添加2g/L活性碳)，在光周期(光照8h、黑暗16h)，温度周期(光照20℃、黑暗18℃)的条件下诱导试管薯。诱导约8～10周后，采收试管薯进行遗传转化。

1.3马铃薯的遗传转化

将准备好的质粒转入根癌农杆菌菌株LBA4404，准备浸染菌液。试管薯切片厚度约1～2mm，侵染10min，将切片吸干浸染液转入P1培养基(MS培养基，添加6-BA 0.5mg/L+ZT 2.0mg/L+GA30.2mg/L+IAA 1.0mg/L)。将浸染后的材料暗培养48h，转入P1培养基(添加400mg/L头孢霉素、潮霉素)上进行分化筛选培养。转化30d以后，待薯片表面分化出幼芽，将生长1～2cm的幼芽剪下，转移到MS培养基(添加200mg/L头孢霉素、筛选剂潮霉素)进行生根筛选。通过试管薯切片作为外植体转化，采用了2、4、6、8、10、12mg/L潮霉素筛选浓度进行预实验，并最终采用2mg/L的潮霉素进行筛选。通过筛选获得的再生植株转入含有10mg/L潮霉素的MS培养基进行生根筛选，最后转入泥炭土定植，观察生长发育情况并采收微型薯。

1.4马铃薯阳性植株分子水平的检测

检测引物见表1。提取马铃薯植株总RNA的提取并反转录获得cDNA。cDNA纯度的检测采用马铃薯RbcS基因，有基因组DNA污染的样品可以扩增到约500bp的片段，马铃薯的cDNA只能扩增到约140bp的片段。转录水平检测以马铃薯的细胞延长因子(Ef-1)作为内参。转基因株系和野生型株系取叶片提取蛋白。定量后的样品等蛋白量上样电泳，采用EcTSR、EcGCL、AtGDH蛋白相应的抗体进行Western blot分析。

表1 马铃薯转基因植株分子检测的引物

2 结果与分析

2.13个目标基因的表达盒成功构建到多基因表达载体

图2 pYL-GCL-GDH-TSR构建过程的酶切鉴定

通过两轮的重组以及一次酶切连接，3个基因的表达盒成功连接到受体载体。两个供体载体pDonor1、pDonor2在多克隆位点的两端设计有限制性内切酶NotI的识别位点，通过重组接入受体载体的表达盒可以通过NotI酶切检测。从图2可以看出，第1轮接入AtLDH表达盒和第2轮接入的TSR表达盒均在相应大小的位置出现了条带，表明二者均顺利接入了受体载体。通过测序分析，认为目标载体没有出现错配和序列丢失，3个目标基因的表达盒成功构建到多基因表达载体。

2.2马铃薯试管薯外植体潮霉素筛选体系的建立与转基因植株的获得

潮霉素通过抑制植物蛋白质的合成，进而影响植物的生理代谢。在诱导再生的培养基中添加1mg/L的潮霉素，经过农杆菌浸染的试管薯切片接触培养基的一面边缘出现发黑，随着筛选时间的延长，切片大量死亡。在2mg/L潮霉素浓度以上的筛选压力下，试管薯切片可以在不接触培养基的另一侧产生少量愈伤组织，但是这些愈伤组织不会分化，继续筛选后，这些试管薯切片逐渐褐化死亡，但这个阶段持续的时间很长。马铃薯试管薯切片在筛选培养基再生的芽有4种情况(图3)，从试管薯切片不接触培养基的一侧直接分化的再生芽占很小比例。此外，相对于生根阶段，马铃薯在愈伤组织的分化阶段对潮霉素敏感程度较高。

2.3转基因马铃薯材料的分子检测

在获得马铃薯的转化阳性株系中，选择株系PGLT进行分子检测。在DNA水平，筛选基因HPT和目标基因EcGCL、EcTSR、AtGDH均能在PGLT株系中检测到，而野生型无法扩增到相应的条带。扩增条带的大小符合预计长度，并和阳性CK扩增长度相同(图4 A、B、C、D)。在RNA水平，PGLT和野生型植株的cDNA中，采用35个循环扩增，没有扩增到含有内含子的条带(图4 E)，表明cDNA中没有基因组DNA的污染。通过半定量RT-PCR检测，可以检测到筛选基因HPT和3个目标基因EcGCL、EcTSR、AtGDH的正常转录(图4 F、G、H、I)。

2.4转基因马铃薯株系的表型

转基因植株PGLT表现为潮霉素抗性(图5A)，说明潮霉素磷酸转移酶可以正常表达蛋白并表现潮霉素磷酸转移酶活性。试管苗经过快速繁殖，移栽到蛭石后，存活并生长发育良好，将幼苗移栽到泥炭土基质后，转基因植株和野生型均能正常的生长，在约90d后，采收到微型薯(图5B)。整个移栽体系可以满足马铃薯遗传转化的需要。经过两代的种植，转基因植株相对于野生型没有明显差异。转基因株系的微型薯偏小，但差异不显著(图5C)。

3 讨论

3.1潮霉素可以用作马铃薯遗传转化的筛选剂，但效率较低

在马铃薯的遗传转化中，既可用叶片、叶柄、茎段为外植体，通过愈伤组织途径建立再生体系，也可以试管薯、微型薯、薯块为外植体，建立直接分化再生转化系统[8～11]。本研究在预实验阶段发现茎段的再生体系极不稳定，叶片浸染的操作难度较大，最终放弃了采用茎段和叶片作为外植体进行遗传转化，改为采用试管薯作为外植体进行遗传转化。

在多基因转化的方法中，可以采用进行逐步转化，但是需要2个以上的筛选标记。潮霉素和卡那霉素是植物遗传转化中两种常用的筛选剂，但是一般认为单子叶植物如水稻一般使用潮霉素作为筛选剂。采用试管薯切片作为外植体，卡那霉素作为筛选剂可以取得较好的效果[12～14]。本研究采用潮霉素作为筛选剂，发现马铃薯试管薯切片再生阶段对其极为敏感，采用2mg/L的筛选压力仍然较高，这与马铃薯生根阶段10mg/L的筛选压力以及块茎作为外植体再生的筛选压力相比有很大的差别[15]。如果降低筛选压力，就会造成大量的芽再生，一方面增加筛选的难度，另一方面由于转化苗具有代谢上的负担，从而竞争不过非转化苗，最终造成筛选失败。

图4 马铃薯转基因株系PGLT的PCR检测

图5 马铃薯野生型和转基因株系试管苗移栽与微型薯

潮霉素可以用作马铃薯遗传转化的筛选剂，但效率没有卡那霉素作为筛选剂的高。马铃薯的多基因转化中，潮霉素筛选体系的低效率使逐步转化法难以实现。另一方面，由于马铃薯使用无性繁殖，并且马铃薯是四倍体，不能采用杂交的方法进行多基因转化。因此，在马铃薯的多基因遗传转化中，如果将多基因转化载体改造为卡那霉素抗性，然后进行多基因的组装，可能会具有更高的转化效率。

3.2多基因一次性转化与叶绿体定位的双重要求增加了蛋白有效表达的难度

在本研究中，通过多基因表达载体成功地在RNA水平表达了抗性筛选标记基因和3个目标基因。但是在马铃薯转基因株系的蛋白检测中，3个目标基因均没有检测到蛋白水平的表达。经过2代的种植，转基因植株表型与野生型植株也没有出现明显表型差异。出现上述情况，可能有以下2方面的原因。

第一，在植物的叶绿体中构建一个新的代谢步骤，基因表达量的不协调，会造成中间产物的积累，以致对叶绿体造成毒害。采用表达盒堆积法在植物中进行多基因表达，表达的不协调将更加明显，这与启动子的使用、表达盒的位置、表达盒的方向均有关系[16～18]。在Kebeish等[1]的研究中，通过逐步转化以及利用杂交的方法转入了5个基因。在本研究中，采用拟南芥的AtGDH将乙醇酸转化为乙醛酸，而细菌的乙醇酸代谢途径中的乙醇酸脱氢酶含有3个亚基，这样做减少了需要转入基因的数目，减轻了遗传转化的压力。然而，如果AtGDH的表达量过高，而GCL和TSR基因表达量较低，可能会导致乙醛酸在叶绿体中积累。要解决上述问题，必须在启动子的使用、表达盒的位置方向安排上进行调整，同时，也需要大量的转化株系进行筛选。

第二，目的基因的叶绿体定位异常。细胞核编码的蛋白质需要运输到叶绿体、内质网、液泡等细胞器发挥作用，在蛋白质的各级结构中，有部分氨基酸用来编码蛋白质定位信号。质体定位的蛋白质出现定位信号肽是质体进化上的关键步骤[19]。定位信号肽的出现是一个漫长的进化过程，物种之间、蛋白之间的定位信号肽会存在极大差异。传统观点认为，由核编码的质体蛋白其N端的信号肽包含有其定位及切割的全部信息[20]。定位外源蛋白在研究中应用的比较多的是马铃薯rbcs的小亚基叶绿体定位信号肽。此外，番茄、水稻，拟南芥的叶绿体定位信号肽也是比较常用的信号肽[21～23]。Lee等[20]对拟南芥的208种叶绿体定位信号肽序列进行了聚类分析发现，这些定位序列可以分为多个序列亚群，对其中的7个序列亚群进行实验发现，定位序列具有高度的特异性；蛋白的定位实验表明，每种蛋白包含了严格的叶绿体定位序列区。该研究认为，信号肽是由多个包含了特异序列的序列亚群组成的。本研究中，使用水稻rbcS的叶绿体定位信号肽在马铃薯中定位3个目标蛋白，目标蛋白在RNA表达量极高的情况下没有在蛋白水平检测到表达，这可能是由于不同物种的不同蛋白对叶绿体定位信号肽具有特异性而造成的。

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2017-04-17

国家自然科学基金项目(31470343)；长江大学青年基金项目(2015cqn83)。

姚振(1980-)，男，博士，讲师，研究方向为植物学和植物生理学。通信作者: 彭新湘，xpeng@scau.edu.cn。

[引著格式]姚振,沈博然，彭新湘.LoxP-Cre重组技术在构建马铃薯光呼吸代谢支路中的应用[J].长江大学学报(自科版)，2017,14(18)：37～43.

Q945.19

A

1673-1409(2017)18-0037-07

[编辑] 李启栋