蛋白质组学在中药方剂药理研究中的应用进展

刘玉倩　詹淑玉　阮钰尔　左志燕　季晓明　王帅杰　丁宝月

[摘要]中药方剂是中药临床治病的重要手段，其多组分、多靶点、整合调节的作用特点迫切需要运用现代先进的科学技术手段来揭示其复杂的作用机制。蛋白质组学系统性、全方位的研究模式正好与中药方剂的作用特点相契合，已经逐渐广泛应用于中药方剂的药理作用机制研究中。该文对近年来蛋白质组学在中药方剂抗心脑血管疾病、抗肝脏疾病、抗糖尿病、抗癌、抗类风湿性关节炎以及其他疾病的药理研究中的应用进行了综述，并提出未来发展的方向，以期为中药方剂作用机制的蛋白质组学研究提供思路和方法参考。

[关键词]蛋白质组学； 中药方剂； 药理研究

[Abstract]Chinese medicinal formulae are the important means of clinical treatment in traditional Chinese medicine It is urgent to use modern advanced scientific and technological means to reveal the complicated mechanism of Chinese medicinal formulae because they have the function characteristics of multiple components， multiple targets and integrated regulation The systematic and comprehensive research model of proteomic is in line with the function characteristics of Chinese medicinal formulae， and proteomic has been widely used in the study of pharmacological mechanism of Chinese medicinal formulae The recent applications of proteomic in pharmacological study of Chinese medicinal formulae in anticardiovascular and cerebrovascular diseases， antiliver disease， antidiabetic， anticancer， antirheumatoid arthritis and other diseases were reviewed in this paper， and then the future development direction of proteomic in pharmacological study of Chinese medicinal formulae was put forward This review is to provide the ideas and method for proteomic research on function mechanism of Chinese medicinal formulae.

[Key words]proteomic； Chinese medicinal formulae； pharmacological study

中藥方剂是针对具体病证，按照组方原则选择药物，酌定用量，规定适宜剂型及用法的中药组合，是中医辨证施治的具体体现，也是中药临床治病的重要手段。方剂中多味药通过“君臣佐使”的配伍规律，形成一个复杂的化学体系，该复杂体系中的各个化学成分之间通过协调作用方式，影响和调节与疾病相关的各个环节和通路的功能状态，从而整体性、系统性地发挥其防病治病的作用。方剂特有的多组分、多靶点、多环节整合调节作用模式，是其区别于西药的特色和优势所在。但是，也正由于中药方剂多组分、多靶点、多环节作用的复杂性，给中药药效物质基础和作用机制研究带来了困难和挑战，因此，迫切需要应用现代科学发展的新技术和新手段，探索适合中药方剂研究的新方法和新模式，才能使中药研究真正迈向现代化[1]。

随着生命科学的研究进入了后基因组时代，基于各种组学，如蛋白质组学（proteomics）等技术平台的系统生物学成为了中药现代化研究的重要工具[2]。蛋白质组学采取系统的、全方位的研究模式，通过高效率、高灵敏度、高通量的技术手段，全面揭示生物基因组表达的所有蛋白质在生命进程中的表达与功能特质，其研究特点正好与中药方剂整体性和系统性的作用特点相契合。因此，将蛋白质组学技术应用于中药方剂药理作用研究，无疑将对揭示中药方剂的作用机制，筛选药物作用靶标以及优化中药方剂的合理配伍等具有重要的意义[3]。近年来，蛋白质组学技术在中药方剂抗心脑血管疾病、抗糖尿病、抗癌和抗消化系统疾病等机制研究中得到了较广泛的应用。本文就近十几年来蛋白质组学在中药方剂药理研究中的应用做一综述。

1抗心脑血管疾病

中药方剂多组分、多靶点、整合调节的作用特点一直在心脑血管疾病防护中发挥着重要作用，但是关于其复杂的作用机制仍是目前研究、探讨的热点。近年来研究者较多采用蛋白质组学技术寻找与疾病及中药方剂调控作用相关的蛋白靶点及信号通路，尝试从分子水平揭示中药方剂对心脑血管疾病的整合保护作用机制（表1）。Chen等[4]采用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）蛋白质组技术结合LCMS/MS研究滋补脾阴方对糖尿病综合征诱导的小鼠脑损伤的防护机制。研究结果分别在对照组与疾病组、疾病组与给药组之间发现了24和23个差异表达蛋白，经分析得出生长因子受体结合蛋白2可能是滋补脾阴方发挥神经保护作用的分子靶点。笔者所在课题组[5]采用基于二维凝胶电泳（2DE）结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS/MS）鉴定的比较蛋白质组学方法研究了中药复方生脉注射液对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌保护作用的分子机制，研究结果发现和鉴定了14个与生脉注射液调控作用相关的心肌差异蛋白，这些蛋白主要与心肌能量代谢过程相关，通过对蛋白的生理功能及其相互作用关系分析，说明生脉注射液可能部分通过调节多条能量代谢相关通路：促进糖代谢、抑制脂代谢、恢复三羧酸循环和促进呼吸链ATP生产功能等协同作用优化心肌能量代谢、提高心肌能量代谢效率，并最终起到心肌保护的作用。Qi等[6]运用蛋白质组学研究桃红四物汤对氧糖剥夺脑缺血再灌注损伤PC12细胞凋亡的保护机制，经2DE分离对比找到26个与桃红四物汤调控作用相关的蛋白质，经MALDITOF MS鉴定这些蛋白参与多种重要的生化过程，具有不同的生理功能。进一步的定量PCR验证发现其中有6个是与NFE2相关因子2（Nrf2）调节有关的Ⅱ相抗氧化酶，说明桃红四物汤可能是通过调节Nrf2介导的Ⅱ相抗氧化酶而起到神经保护作用。Zhou等[7]研究补阳还五汤抗大鼠冠状动脉左前降支（LAD）结扎造成的心室重构的作用机制，通过蛋白质组学技术发现补阳还五汤能够显著下调心室重构心肌组织中心钠素的表达，而上调热应激蛋白β6（HSPB6）和过氧化物酶基因6（PRDX6）的表达。结合细胞凋亡指数的药效研究表明，补阳还五汤主要通过调节以上3种蛋白从而增加心肌组织Bcl2/Bax的比值、降低蛋白激酶3活性而发挥减缓心室重构的作用。朱立华等[8]则运用蛋白质组学技术研究补阳还五汤促进内源性神经再生的机制，结果发现补阳还五汤给药组蛋白质点表达较模型组主要以下调为主，其中75个点表达下调，35个点表达上调，蛋白质主要涉及相关酶类、细胞骨架等蛋白，为寻找治疗缺血性脑血管疾病的新靶点和新的脑缺血保护药物提供了理论依据。Wang等[9]采用蛋白质组学技术从分子水平考察复方双丹（丹参和丹皮）煎剂抗大鼠急性心肌梗死的作用机制，运用2DE和MALDITOF MS结合技术分离和鉴定了23个差异蛋白，这些蛋白分别与能量代谢、氧化应激和细胞骨架有关，从而整体阐述了双丹煎剂通过调节心肌能量代谢、抗氧化应激损伤等多途径发挥抗心肌梗死的作用。endprint

2抗肝脏疾病

近年来，研究者采用蛋白质组学技术开展了中药方剂抗肝纤维化、肝硬化、非酒精性脂肪肝等保肝作用的机制研究（表2）。Xia等[19]采用iTRAQ技术结合强阳离子交换非液相色谱质谱（SCXnonLCMS/MS）的蛋白质组学方法研究护肝清脂方抗游离脂肪酸诱导的L02肝细胞损伤的分子机制。研究结果鉴定出多种与护肝清脂方保肝作用相关的蛋白质，其功能涉及微生物代谢、脂肪酸代谢、过氧化物酶体增生物激活受体信号和胞外信号调节激酶信号通路等，进一步的研究揭示热应激蛋白27（HSP27）可能在该方抗L02肝细胞损伤的药效中发挥了重要作用。Xie等[20]运用蛋白质组学技术研究中药扶正化瘀方对二甲基亚硝胺（DMN）诱导的肝纤维化大鼠肝组织蛋白质表达的影响，经分离和鉴定，发现12个蛋白在DMN诱导的肝纤维化组织中发生了表达改变，扶正化瘀方可使其中8个蛋白的表达有不同程度的恢复。这些蛋白主要与物质代谢、压力反应以及肌红蛋白激活有关。该研究为肝纤维化的病理生理学以及扶正化瘀方的抗肝纤维化作用机制研究提供了有益的线索。丁赛丹等[21]为了解析下瘀血汤对硫代乙酰胺诱导的肝硬化进展期大鼠肝脏的保护作用及其机制，采用比较蛋白质组学技术分析肝组织总蛋白，结果鉴定了18个蛋白，分别与氧化应激、物质代谢、细胞骨架、炎症反应以及细胞增殖凋亡相关。通过机制解释说明过氧化损伤以及其造成的物质代谢异常是硫代乙酰胺致大鼠肝硬化的重要病理环节，提高机体内在的抗氧化能力及逐步恢复物质代谢能力是下瘀血汤逆转大鼠肝硬化的主要机制之一。

3抗糖尿病

章常华等[25]采用基于nanoLCMS/MS的蛋白质组学技术筛选葛根芩连汤防治胰岛素抵抗作用的血清差异表达蛋白。通过质谱鉴定分析，发现76个差异蛋白，其中上调49个，下调27个，主要涉及细胞周期调控、炎症反应、信号通路调节等生物过程。其中上调蛋白磷脂酰肌醇3激酶、胰岛素受体底物蛋白以及下调蛋白载脂蛋白CⅢ、肝型脂肪酸结合

中药方剂动物或细胞模型病理状况靶点或信号通路蛋白质组方法参考文献

四物汤大鼠心肌组织慢性心衰Suclg2 protein，pyruvate dehydrogenasecomplex，myosin light chain 2，serine protease inibitor A3N2DE，MALDITOF/TOF MS2017[10]

滋補脾阴方小鼠前脑树突棘糖尿病相关认知功能减退protein processing inendoplasmic reticulum，PI3KAkt signaling pathway； growth factor receptorbound protein 2iTRAQ，LCMS/MS2017[4]

生脉注射液大鼠心肌组织心肌缺血再灌注损伤glucose metabolism proteins，lipid metabolism proteins，TCA cycle protein，RspChain protein2DE，MALDITOF MS/MS2015[5]

丹七片小型猪血浆心肌缺血apolipoprotein A1，apoliopoprotein E2DE，MALDITOF MS2014[11]

苦碟子注射液大鼠脑组织缺血性脑卒中火毒证热休克蛋白，1433蛋白，果糖二磷酸醛缩酶C2DE2014[12]

桃红四物汤PC12细胞氧糖剥夺再灌损伤Nrf2mediated phase II enzymes2DE，MALDITOF MS2014[6]

补阳还五汤大鼠脑细胞缺血性脑血管疾病相关酶类，细胞骨架蛋白，热休克蛋白及分子伴侣等2DE，MALDITOF MS2013[8]

补阳还五汤大鼠心肌组织结扎冠脉左前降支致心室重构atrial natriuretic factor （ANF），heat shock protein beta6 （HSPB6），peroxiredoxin6 （PRDX6），Bax and caspase 3 activity2DE，MALDITOF MS2012[7]

双龙方MSCs心肌间质干细胞分化Cytoskeleton，energy metabolism andsignal transduction2DE，MALDITOF MS2010[13]

芪参益气方大鼠心肌组织大鼠急性心肌梗死能量代谢，氧化应激，细胞骨架构成等2DE，MALDITOF MS2009[14]

平肝潜阳方大鼠肾上腺组织高血压肝阳上亢证异柠檬酸脱氢酶，类固醇合成急性调节蛋白，铁轻链蛋白，Tu翻译延长因子，鸟苷酸解离抑制因子，黄素还原酶，Basic转录因子32DE，MALDITOF MS2008[15]

血府逐瘀汤大鼠血清气滞血瘀证2DE2008[16]

双丹方大鼠心肌组织大鼠急性心肌梗死energy metabolism，oxidativestress，cytoskeleton2DE，MALDITOF MS2007[9]

复方丹参片冠心病患者血浆冠心病免疫球蛋白，纤维蛋白原，粒酶，细胞表面糖蛋白2DE，MALDITOF MS2006[17]

复方丹参方血管平滑肌细胞TNFα刺激的血管平滑肌细胞功能失常钙调蛋白依赖蛋白激酶，Nras，基质金属蛋白酶9，p53肿瘤抑制因子，周期素依赖激酶抑制因子p212DE，MALDITOF MS2006[18]

中药方剂动物或细胞模型病理状况靶点或信号通路蛋白质组方法参考文献

护肝清脂方L02 hepatocyteL02肝细胞损伤heat shock protein 27，microbial metabolism，fatty acid metabolism，peroxisome proliferatoractivated receptor signaling，mitogenactivated protein kinase signalingiTRAQ，SCXnonLCMS/MS2017[19]endprint

黄芩&大黄醇提方大鼠肝组织肝纤维化oxidative stress，cytoskeleton dysregulation2DE，MALDITOF MS2015[22]

扶正化瘀方大鼠肝组织肝纤维化aldehyde dehydrogenase，vimentin isoform（CRA_b），gammaactin，vimentin，fructosebisphosphate aldolase B，aldoketo reductase，Sadenosylhomocysteine hydrolase isoform，HSP902DE，MALDITOF MS2013[20]

扶正化淤方大鼠肝组织肝纤维化物质代谢，神经内分泌，细胞增殖凋亡等2DE，MALDITOF MS2006[23]

下瘀血汤大鼠肝组织肝硬化氧化应激蛋白，物质代谢相关蛋白，细胞骨架蛋白，炎症反应相关蛋白，与细胞增殖、凋亡相关蛋白2DE，MALDITOF/TOFMS2012[21]

黄芪汤大鼠肝组织肝纤维化过氧化还原蛋白6，热休克蛋白70，过氧化氢酶2DE，MALDITOF/TOFMS2010[24]

蛋白等可能参与了胰岛素信号传导通路，为研究葛根芩连汤防治胰岛素抵抗的分子机制提供了新靶点。Shi等[26]运用比较蛋白质组学研究滋补脾阴方抗大鼠糖尿病相关的认知衰退。结果发现了12个差异蛋白，其中利用质谱鉴定出9个蛋白，这些蛋白主要涉及能量代谢、细胞骨架调节、氧化应激等，该研究为抗糖尿病相关认知衰退的分子水平研究提供了重要思路。Zhang等[27]采用蛋白质组学技术研究天芪降糖胶囊对2型糖尿病大鼠血清蛋白表达的影响，通过2DE和MALDITOFTOF/MS技术分离和鉴定了11个与糖尿病相关的差异蛋白，其中包括载脂蛋白E、载脂蛋白A在内的7个蛋白在糖尿病模型大鼠血清中的表达发生了改变，而天芪降糖胶囊可以有效回调这些表达改变的蛋白，为该方抗糖尿病作用提供了分子机制解释。

4抗癌

李华成等[28]运用2DE分离、分析膈下逐瘀汤加减方（GXZY）含药血清作用于人肝癌细胞SMMC7721后的相关蛋白质表达变化情况。发现GXZY血清组和空白对照组各有33个蛋白质点高表达，经MALDITOFMS鉴定出6个差异蛋白，其中包括AHCY，PGAM1，STMN1等5个下调蛋白质，1个上调蛋白质TPM4，推测这些差异蛋白可能是GXZY抗癌治疗的作用靶点。陈天池等[29]运用蛋白质组学技术，研究消痰散结方对裸鼠人胃癌MKN45皮下移植瘤模型血清蛋白质组表达的影响。研究结果各组间比较共找到9个差异表达蛋白点。与正常组比较，在模型组中表达上调、在干预组表达回调至正常组水平的3个，鉴定为结合珠蛋白、泛素蛋白连接酶、组蛋白甲基转移酶；与正常组比较，在模型组中表达下调、在干预组表达恢复至正常组水平的有6个，其中3个鉴定为载脂蛋白A1、过氧化物酶1和超氧化物歧化酶。推测消痰散结方对载脂蛋白A1等功能蛋白表达的综合性调节可能是其发挥抗胃癌作用的重要机制。曹永艳等[30]运用血清药理学方法结合蛋白质组学技术研究复方斑蝥胶囊对人肝癌SMMC7721细胞蛋白质组表达的影响，结果找到了47个差异蛋白，经质谱鉴定，发现了4种与肿瘤的增殖、免疫、凋亡相关的差异表达蛋白质，为复方斑蝥胶囊的抗肿瘤作用机制的进一步研究提供了线索。

5抗类风湿性关节炎

Wang等[31]尝试运用2DE结合MALDITOFMS/MS的蛋白质组学技术寻找中药Qingfu Guanjieshu（QFGJS）方抗风湿性关节炎（RA）的蛋白靶点并建立相关的蛋白质组网络。研究结果组间比较共发现了89个差异蛋白，鉴定了其中63个蛋白，并应用基因本体论（GO）方法对其中的32个蛋白进行了功能分类，最后对14个蛋白运用生物信息学进行分析，建立了QFGJS方抗RA作用相关的蛋白质组网络，推测Pgk1可能在QFGJS抗RA药效中发挥了重要作用。杨波等[32]运用蛋白质组学观察痹肿消汤干预胶原诱导性关节炎大鼠滑膜病变的蛋白质改变，发现并鉴定了正常组、模型组和痹肿消汤组大鼠滑膜的差异蛋白质点55个，主要涉及物质代谢、能量产生、物质转运、抗氧化应激、信号转导及细胞骨架蛋白。分析表明实验性关节炎的关节滑膜病变可能与annexin1，aldolase A蛋白有关，痹肿消汤可能通过调控大鼠滑膜相关蛋白质的表达而达到治疗目的。蒋勇前等[33]通过观察痹肿消汤干预前后的早期活动性类风湿性关节炎（RA）患者外周血单个核细胞（PBMCs）蛋白质2DE图谱，寻找RA疾病相关蛋白。经质谱鉴定出14个差异表达蛋白，其功能主要涉及参与物质代谢或能量產生的生物酶类、细胞信号转导蛋白、细胞骨架蛋白、抗氧化蛋白和血液蛋白等，揭示RA发病机制可能与这些蛋白质表达异常有关，而痹肿消汤可能通过对RA患者PBMCs中某些蛋白质表达的调控达到治疗目的。

6抗其他疾病

除了以上主要疾病外，近年来，蛋白质组学技术也在中药方剂抗骨质疏松症、血虚证、高血脂症、肺病、哮喘、胃病、痛经以及延缓衰老等药理作用研究中得到了应用，涉及的中药方剂包括黄芪三仙汤、四物汤、茵陈五苓散、补肺益肾方、消肺清炎丸、胃康宁、香附四物汤以及琼玉膏等（表3）。

7结语

自从1994年澳大利亚学者Wilkins 与Williams 提出蛋白质组概念以来，蛋白质组学已经历了20 多年的发展，该技术已逐渐趋于成熟，被应用于多种学科的研究。目前，蛋白质组学技术在中药研究领域的应用主要包括2个方面：一是中草药生物学研究，阐明中草药药效活性成分的生物合成途径；二是中药药物作用靶点的发现和确认，阐明中药多组分、多靶点、整合调节的作用机制。近年来，与蛋白质组学研究相关的技术得到了长足的进步，如蛋白质样品制备中的分级纯化技术[45]；蛋白质分离中的高分辨率2DE技术[46]、色谱分离技术、毛细管电泳和微流控芯片技术[47]等；蛋白质鉴定中的各种质谱技术[4849]；以及蛋白质组学整体解决方案中的iTRAQ[50]和同量异序标签（tandem mass tag，TMT）[51]等高通量定量蛋白质组学技术。这些技术的发展使蛋白质组学的研究更加精准、深入，也为中药的蛋白质组学提供了更加有利的研究策略和工具。endprint

中药方剂治病符合现代治疗学的发展趋势，并将成为今后药学研究发展的亮点，而探索现代研究新技术、新方法则是中药方剂现代化深入发展的关键。如上所述，蛋白质组学技术已经在中药方剂抗心脑血管疾病、抗肝脏疾病、抗癌和抗糖尿病等多个领域的药理作用机制研究中得到了应用，并取得了一定的进展。但分析现有研究可以看出，目前蛋白质组学技术在中药方剂作用机制的研究中仍然处于初级阶段，大部分研究仅局限于探讨中药方剂调控相关的蛋白质表达谱的变化，揭示可能的蛋白靶点，而没有更深入的对机制的探索。笔者认为要想运用蛋白质组学技术真正阐明中药方剂多组分、多靶点、整合调节的作用机制，至少在2个方面需要深入研究，一是需挖掘各個蛋白靶点之间的网络联系，

相关病症中药方剂动物或细胞模型靶点或信号通路蛋白质组方法参考文献

骨质疏松症黄芪三仙汤大鼠成骨细胞Nformyl peptide receptor 2，heparan sulfate （glucosamine） 3Osulfotransferase 3A1，alphaspectrin，prohibitin，transcription elongation factor B （SIII），polypeptide 12DE，MALDITOF/TOFMS2015[34]

EXD煎剂osteoblastic UMR106 cells，osteoclastsinduced from RAW 2647 cellsheatshock protein 1，high mobility group protein （Hmgb1），acidic ribosomal phosphoprotein P0，histone 2，carbonyl reductase 1，ATP synthase，aldolase A，Rho GDP dissociation inhibitor （GDI）alpha2DE，MALDITOF/MS2010[35]

血虚证四物汤大鼠肝线粒体热休克蛋白60，电子转移黄素蛋白，抑制素，过氧化氢酶，NADH脱氢酶等2DE，MALDITOF MS2010[36]

四物汤血虚证小鼠骨髓蛋白碳酸酐酶I，annexin A1，肌动蛋白结合蛋白，peroiredoxinV2DE，MALDITOF MS2006[37]

高血脂症茵陈五苓散大鼠血浆lipid metabolism，blood coagulation，antiinflammation and substance transport2DE，MALDITOF MS2016[38]

慢性阻塞性肺疾病补肺益肾方大鼠肺组织lipid metabolism，inflammatory response，oxidative stress and focal adhensioniTRAQ，LCMS/MS2016[39]

哮喘清肺消炎丸荷兰猪肺组织Hsp90α，Mapk3，VIM，focal adhesion pathway，cellextracellular matrix interactions pathway，TGFbeta signaling pathways，NK cellmediated cytotoxic pathway2DE，MALDITOF MS2013[40]

胃病胃康宁大鼠胃肠道组织glutathione Stransferase，pi2，superoxide dismutase 2，aenolase and voltagedependent anion channel2DE，MALDITOF MS2011[41]

痛经香附四物汤小鼠卵巢组织ADRM1蛋白nano LCLTQOrbitrapMS/MS2016[42]

延缓衰老琼玉膏大鼠下丘脑ST18，Ptprc，PSMB8，INPP4B，Shc3，Pik3r1，PIP5K1C，Nampt，Rasgrp2，Asah2，Pdpk1，Map2k7iTRAQ2016[43]

琼玉膏大鼠下丘脑synapse formation protein，mitochondrial protein，energy metabolism related protein，antioxidant protein，cytoskeletal protein2DE，MALDITOF/TOF MS2014[44]

比较不同有效成分之间靶蛋白及其生物功能的相关性，借助网络药理学、生物信息学等技术来阐述中药方剂各组分在分子水平的协同作用，从而更精确地阐述药物作用机制。二是开展中药方剂靶点蛋白翻译后修饰的研究，蛋白质翻译后修饰是蛋白质发挥功能的主要方式，对经过翻译后修饰的蛋白质及蛋白质组的调控过程进行深入研究是未来蛋白质组学的主要发展方向，而对中药方剂作用机制的蛋白质组学研究也必然需要向这一方面发展。相信随着蛋白质组学技术的不断进步，必将为中药方剂这一复杂物质体系的药理作用提供更加精准的机制解析。

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[责任编辑张宁宁]endprint