不同能量Er,Cr:YSGG激光照射对牙体硬组织抗酸作用的体外研究

刘思婧 李涢

临床医学研究

不同能量Er,Cr:YSGG激光照射对牙体硬组织抗酸作用的体外研究

刘思婧 李涢

目的探讨Er,Cr:YSGG激光照射能量与牙体硬组织抗酸性之间的关系。方法采用2.5、 3.5、 5 W激光照射牙釉质样本， 2、 3、 4 W激光照射牙本质样本。经0.1 mmol/L乳酸液浸泡24 h后检测钙磷溶出量，能谱仪检测样本表面钙磷原子百分比，SEM观察表面形态。结果除2.5 W牙釉质组，其余牙釉质和牙本质实验组钙磷溶出量显著低于对照组(P<0.05)，实验组间无明显差异。激光照射后牙釉质钙磷比增加，牙本质钙磷含量均无变化。SEM观察显示实验组样本表面粗糙，釉柱间隙增大，牙本质小管口周牙本管突出成袖口状。结论一定能量的Er,Cr:YSGG激光照射可使牙硬组织抗酸性提高。

Er,Cr:YSGG激光； 牙釉质； 牙本质； 抗酸性

Er,Cr:YSGG激光是新一代水动力激光治疗系统，当激光被工作端喷出的水雾吸收后，水雾体积急剧膨胀，产生微爆裂，可以达到切割组织的效果[1]。因其采用了非接触式和点状切割的工作方式，可避免涡轮机切割时产生的振动感，具有无痛治疗效果[2]和避免牙髓不可逆性损伤[3]的优势，因而在龋病的预防和治疗中具有良好的应用前景。研究显示，Er,Cr:YSGG激光照射能增强牙体硬组织的抗酸性[4-8]，但尚不明确激光能量的改变与牙体组织抗酸性变化之间的关系。本研究分别选取多种激光能量进行牙面照射，经体外脱矿后检测钙磷溶出量，以了解不同激光能量对牙体组织抗酸性的影响；同时采用能谱检测仪(X-ray energy dispersive spectroscopy，EDS)检测样本表面钙磷含量、采用SEM观察牙体表面形态，探究牙体组织抗酸性变化的机制，为临床治疗提供实验依据及指导。

1 资料与方法

1.1 实验仪器和试剂

Er,Cr:YSGG水激光口腔治疗仪Waterlase MD(Biolaser, 美国); 全自动生化检测仪， 冷场发射扫描电子显微镜S-4800(日立，日本); 超声波清洗机(Branson，美国); 乳酸液(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 离体牙收集

收集2014-08～2014-10在北京口腔医院因牙周病、冠周炎等原因拔除的24 颗第三恒磨牙和48 颗恒切牙，要求牙冠完整，无龋坏、无缺损、无变色、无裂纹，无釉质发育不全，排除氟斑牙、四环素牙、死髓牙。

1.3 脱矿实验过程

1.3.1 样本制备 磨除48 颗切牙牙根，牙冠唇面釉质作为实验面向外，包埋于自凝塑料内，制成48 个牙釉质样本。将24 颗第三磨牙沿近远中向切开，磨除牙根和颊或舌/腭面釉质，牙本质作为实验面朝外，包埋于自凝塑料内，制成48 个牙本质样本。以上样本实验区用水磨砂纸由粗到细(250、500、1 000 目)打磨。

1.3.2 实验分组及处理 随机选取40 个牙釉质样本和40 个牙本质样本，各自分为5 组， 即3 个实验组、涡轮对照组和空白对照组。每组8 个样本，实验区大小均为3 mm×3 mm。

釉质实验组分别使用2.5、 3.5和5 W的激光能量照射，牙本质实验组采用2、 3和4 W的激光能量照射。对照组采用高速涡轮机EX-21型号金刚砂车针均匀磨除0.5 mm厚的牙体组织。空白组不做处理。

激光照射方法：将激光手柄固定，样本放置于工作平台上匀速平移，保持激光纤维头末端与样本实验区之间距离始终为1 mm。照射时间为6 s，照射区域呈线状，激光纤维头直径为0.6 mm，脉宽140 μs，脉冲频率为20 Hz，气水量为：牙釉质空气量75%，水量85%；牙本质：空气量65%，水量75%。

样本经处理后，超声荡洗15 min，实验区以外的区域涂双层抗酸指甲油，晾干。

1.3.3 体外脱矿及钙、磷离子溶出量的检测 将每个样本分别浸入8 ml pH=4.8的0.1 mmol/L的乳酸液中，37 ℃静置24 h，然后取出样本，使用全自动生化分析仪测定脱矿液中钙、磷离子浓度，以此代表钙磷溶出量。

1.4 激光照射样本表面的钙磷原子含量检测

将余下的8 个牙釉质和8 个牙本质样本分区进行激光照射，即每个样本表面划分5 个实验区域，大小均为1.5 mm×1.5 mm，以涡轮磨切和不处理为对照，分别进行上述多种能量激光照射，照射方式和参数设置同上。样本超声荡洗15 min后，自然干燥，表面喷金，在扫描电镜视野下，采用EDS检测各个区域的钙磷原子百分比。

1.5 扫描电镜观察牙体表面形态

随机选取能谱分析后的牙釉质标本2 个，牙本质标本2 个，采用扫描电镜在1 000 倍放大视野下观察样本实验区的表面形态。

1.6 统计学分析

使用SPSS 22.0统计软件，采用Kruskal-Wallis检验，比较牙釉质和牙本质各5 组的钙磷溶出量，同时对表面钙磷原子百分比、钙磷比进行统计学分析，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 样本肉眼观察结果

各样本经过激光照射后，表面粗糙不平整，未见明显碳化，牙釉质表面呈白垩色改变。

2.2 钙磷溶出量的测定结果

各组样本脱矿后钙磷离子溶出量见表 1。

经Kruskal-Wallis检验分析，牙釉质各组和牙本质各组钙磷溶出量差异具有统计学意义(P<0.01)。牙釉质样本中，3.5 W组和5 W组钙溶出量均低于对照组和空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)， 3.5 W组和5 W组之间的差异无统计学意义(P>0.05)； 3 个实验组磷溶出量低于对照组和空白组，差异具有统计学意义(P<0.05)。牙本质样本中， 3 个实验组钙磷溶出量均低于对照组和空白组样本，差异具有统计学意义(P<0.05)，不同实验组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。 同一类型样本的涡轮组和空白组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。

Tab 1 The cumulative aount of dissoved Ca and P of the samples in lactic buffer solution after 24 h

(mmol/L，±s)

注： ①与牙釉质涡轮组相比较,P<0.05； ②与牙釉质空白组相比较,P<0.05； ③与牙本质涡轮组相比较,P<0.05； ④与牙本质空白组相比较,P<0.05

2.3 样本表面钙磷含量的EDS测定结果

经EDS检测，各组样本表面钙磷原子百分比和钙磷比见表 2。

注： ①与牙釉质涡轮组相比较,P<0.05； ②与牙釉质空白组相比较,P<0.05

牙釉质组结果：经Kruskal-Wallis检验分析，牙釉质5 组之间钙原子重量百分比的差异无统计学意义(P>0.05)，磷原子重量百分比和钙磷比的差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组和空白组牙釉质样本相比，实验组的钙原子百分比无明显变化，磷原子百分比明显下降，钙磷比明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组之间的差异无统计学差异(P>0.05)。

牙本质组结果：牙本质5 组之间钙原子重量百分比、磷原子重量百分比和钙磷比的差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 扫描电镜观察结果

SEM下激光照射区牙体组织表面均呈粗糙不平整状，未见玷污层、熔融或碳化痕迹。牙釉质部分剖面可见明显釉柱间间隙，激光能量越大，相邻釉柱之间间隙越大(图 1A～C)。牙本质则可见小管口清晰。多数牙本质小管口周围的管周牙本质突出，管间牙本质凹陷，似“袖口状”(图 2A～D)。

A: 2.5 W激光照射后; B: 3.5 W激光照射后; C: 5 W激光照射后; D: 涡轮机磨切后; E: 正常牙釉质表面

图 1 各组牙釉质样本表面形态 (SEM, ×1 000)

A: Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 2.5 W; B： Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 3.5 W； C： Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 5 W； D： Enamel surface prepared using diamond burs; E: Untreated normal enamel surface

A: 2 W激光照射后; B: 2 W激光照射后; C: 3 W激光照射后; D: 4 W激光照射后; E: 涡轮机磨切后; F: 正常牙本质表面

图 2 各组牙本质样本表面形态

A: Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 2 W; B: Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 2 W; C: Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 3 W; D: Irradiated by Er, Cr:YSGG laser of 4 W; E: Prepared using diamond burs; F: Untreated normal dentin surface

Fig 2 Surface morphology of the dentin samples

3 讨 论

自1989 年Kayano等[7-9]发现Er:YAG激光消融后周围的牙釉质抗酸性增强以来，出现大量关于铒激光照射增强牙体组织抗酸性的研究。比如Hossain及乔丽艳等人发现，采用6 W Er,Cr:YSGG激光照射后的牙釉质和5 W或4 W激光照射后的牙本质在乳酸脱矿液中钙离子溶出量低于空白对照组。尽管还有学者探究了不同的激光照射条件对牙体组织抗酸性的影响，但由于采用的仪器不同，所使用的能量多数尚低于对组织产生切割效果的能量级别[10]，因此还不确定，在Er,Cr:YSGG激光达到切割牙体组织的能量范围时是否均具有同样的抗酸效果。

本实验采用的Er,Cr:YSGG水动力激光治疗系统在喷水条件下，采用2 W以上的激光能量即能达到硬组织被切割的效果[11]。在考虑本实验采用的能量范围时，我们发现如果能量设置过高会对牙体组织造成热损伤。有研究指出当能量达到4.5 W时，电镜下牙本质表面可见熔融物，正常组织形态有破坏[12]，因此，我们选用2、 3、 4 W的激光能量照射牙本质。同时选用了稍高的能量(2.5、 3.5、 5 W)照射牙釉质。因为激光切割牙本质的效率高于牙釉质，一方面正常牙本质的显微硬度约为牙釉质的1/5，牙釉质抵抗破坏的能力强于牙本质；另一方面，牙本质中有机物和水含量均明显高于成熟的牙釉质，而波长为2.79 μm的Er,Cr:YSGG激光极易被水吸收，牙本质中的水分子吸收能量后可以较快达到一定的切割效果。因此，为了既能避免对牙釉质和牙本质造成热损伤，又能与临床操作的选择相近，我们选用本实验中的几个激光能量级别进行牙体组织照射。实验结果也证实电镜下未发现实验区组织表面出现热损伤。

本研究结果显示，除2.5 W牙釉质组外，其余实验组钙磷溶出量均明显低于涡轮组和空白组，说明一定能量的Er,Cr:YSGG激光照射后可增强牙釉质和牙本质的抗酸性。这与Hossain等学者的研究结果相似[7-8]。 2.5 W组钙溶出量较对照组也有下降趋势，但差异无统计学意义，提示低能量激光照射牙釉质抗酸性的提高不明显。Diaz-Monroy等[10]也发现在使用较低的Er:YAG激光能量制备窝洞后牙釉质抗酸性无明显变化。

激光照射后牙体组织抗酸性增加的机制主要与组织表面温度变化有关。一种解释是热效应导致牙体组织碳酸盐和结晶水减少，纯化了羟基磷灰石，并在照射后可能形成焦磷酸盐，改变牙体微晶结构，降低溶解性[13]；另一种解释是热效应使有机基质变性，占据牙体组织中的空隙，造成渗透性下降，可以阻碍无机物溶解，促进再矿化[14-15]。

通过EDS检测，本实验发现激光照射后牙釉质表面Ca/P比值有明显增高，这与Diaz-Monroy等[16]的研究结果相似，有学者分析，这可能是由于激光导致照射区温度增高，使得组织表面生成抗酸性略高于碳酸化羟基磷灰石和碳酸盐的β-Ca3(PO4)2，达到了纯化羟磷灰石的效果，因而，被照射后的样本整体抗酸性增强。而Mine等[13]则认为造成牙体组织Ca/P比值降低的原因可能是，在热效应的作用下组织会生成抗酸性高的焦磷酸盐，使得磷含量增加，Ca/P比降低。本实验激光照射后牙本质表面钙磷含量及Ca/P比值较正常牙体组织均无明显差异，这与Shahabi等[17]的研究结果相似，说明，牙本质抗酸性增加不仅可能与组织成分或分子晶体改变有一定关系，还可能与牙本质中更为丰富的有机基质发生变性，降低组织渗透性有关。激光照射后牙体组织抗酸性改变及其机制还没有明确定论，还需要更深入的研究以明确激光照射与牙体抗酸性变化之间的关系，深入了解激光的作用机制。

本研究中，牙本质3 个实验组之间、牙釉质3 W组和5 W组之间钙磷溶出量无明显统计学差异。说明在一定的能量范围内，不同的激光能量不会显著影响牙体硬组织抗酸性的变化程度。原因可能是这些激光能量能充分激活水雾和组织中水分，使组织表面温度变化达到改变组织结构和成分的程度；而激光脉冲式的照射方式，会减少热积累而使组织表面温度变化差异不明显。

综上所述，除了2.5 W能量照射牙釉质外，我们选用的Er,Cr:YSGG激光能量参数照射均可使牙体组织获得一定的抗酸性，但口内条件下是否能达到良好的抗酸防龋效果还有待进一步研究。

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TheeffectofEr,Cr:YSGGlaserirradiationontheacquiredacidresistanceofenamelanddentininvitro

LIUSijing，LIYun.

100050Beijing,DepartmentofEndodontics,SchoolofStomatologyCapitalMedicalUniversity,China

Objective: To investigate the acid resistance of tooth hard tissues irradiated by different power outputs of Er,Cr:YSGG laser.MethodsSamples in laser groups were irradiated using Er,Cr:YSGG laser with the power outputs of 2.5, 3.5 and 5 W for enamel and 2 W, 3 W and 4 W for dentin, respectively. The calcium and phosphate ion dissolved was measured after decalcification in lactate buffer solution for 24 h. The atomic percentage of calcium and phosphate on the surface of samples was examined by X-ray energy dispersive spectroscopy and the morphological changes were investigated by SEM.ResultsIn all laser groups of enamel samples except 2.5 W group calcium and phosphate ion dissolved less than in control group and block group(P<0.05). There's no statistic difference between different power groups. Compared with control group and block group, Ca/P ratio increased(P<0.05). There's no statistic difference of the atomic percentage of Ca and P on the surface of dentin samples between each 2 groups. SEM observation showed that the surface of the laser irradiated samples was rouph, the space among enamel fibers was increased, the dentin around dentinal tuble orifice was protruded and looked like collar flange.ConclusionEr,Cr:YSGG laser irradiation with a range of power is effective in increasing acquired acid resistance of dental hard tissue. There was no relationship between laser power outputs and acid resistance.

Er,Cr:YSGGlaser;Enamel;Dentin;Acidresistance

国家自然科学基金(编号： 81400515)

100050 北京， 首都医科大学口腔医学院牙体牙髓科[刘思婧(现在重庆医科大学附属口腔医院) 李涢]

李涢 010-57099232 E-mail： liyun_prc@126.com

R780.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.008

(收稿： 2016-12-07 修回： 2017-06-06)