2型糖尿病患者KCNJ11启动子区甲基化与胰岛β细胞功能的相关性研究

李雯翀，朱咏瑶，刘抐岢，陈毅光，林志坚

(东莞市第三人民医院内分泌科1、检验科2，广东 东莞 523320)

2型糖尿病患者KCNJ11启动子区甲基化与胰岛β细胞功能的相关性研究

李雯翀1，朱咏瑶1，刘抐岢1，陈毅光1，林志坚2

(东莞市第三人民医院内分泌科1、检验科2，广东 东莞 523320)

目的探讨2型糖尿病(T2DM)患者KCNJ11启动子区甲基化与基因转录表达、胰岛素抵抗指数(Homa-IR)、胰岛β细胞功能指数(Homa-β)等指标的关系。方法选取2014年4月至2015年4月在东莞市第三人民医院内分泌科初治的T2DM患者15例，根据糖化血红蛋白(HbA1c)水平，将HbA1c≤9%的患者纳入A组(n=5)，HbA1c＞9%者纳入B组(n=10)；选择15例健康者纳入对照组。用亚硫酸盐法测定KCNJ11基因启动子5'端300 bp中的46个CpG位点DNA甲基化水平，用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定KCNJ11基因转录表达，并对KCNJ11启动子区甲基化与Homa-IR、Homa-β的关系进行相关性分析。结果对照组受检者的CpG+62、CpG+66、CpG+351甲基化比率分别为(58±24)%、(46±17)%、(96±8)%，A组分别为(60±19)%、(42±18)%、(99±7)%，B组分别为（60±18）%、(41±20)%、(98±4)%，三组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；T2DM组与对照组mRNA表达分别为（1.27±0.56）、(0.95±0.49)，差异无统计学意义(P＞0.05)；B组患者的CpG+66与Homa-IR呈负相关(r=-0.696，P＜0.05)，CpG+62与CpG+66甲基化总和则与Homa-β呈负相关(r=-0.664，P＜0.05)。结论2型糖尿病患者KCNJ11启动子区甲基化可能与胰岛β细胞分泌胰岛素的功能相关，并参与2型糖尿病的发病。

2型糖尿病；DNA甲基化；聚合酶联反应；基因

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)发病机制异常复杂，近年来基因研究已成为糖尿病发病机制研究的热点，一些影响胰岛素分泌、胰岛素作用的基因位点发生变异，共同作用导致糖尿病的发病。内向整流加通道Kir6.2亚基主要分布在胰岛素β细胞，与磺酰脲受体1共同组成了β细胞ATP敏感性钾通道(K-ATP通道)，在胰岛素分泌的作用过程中发挥着十分重要的作用[1]。因此，编码构成K-ATP通道两亚基的基因是研究T2DM发病机制的重要候选基因。Kir6.2亚基由KCNJ11基因编码，是目前得到较好重复的基因之一。越来越多的研究发现遗传与表观遗传机制共同在T2DM患者的发病过程中起重要作用[2]。本研究探讨T2DM患者KCNJ11启动子区甲基化与其mRNA、糖化血红蛋白(HbA1c)、胰岛素抵抗指数(Homa-IR)、胰岛β细胞功能指数(Homa-β)之间的关系，尝试从表观遗传学角度解释T2DM可能的致病机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年4月至2015年4月在东莞市第三人民医院内分泌科确诊的新发T2DM患者15例，其中男性9例，女性6例，平均年龄(57±13.1)岁。根据糖化血红蛋白(HbA1c)水平，将HbA1c≤9%的患者纳入A组(n=5)，HbA1c＞9%者纳入B组(n=10)；选择年龄、性别匹配的无糖尿病、自身免疫性疾病及其家族史的健康志愿者15例纳入对照组，其中男性9例，女性6例，平均年龄(56.7±10.1)岁。排除标准既往明确诊断为糖尿病患者；合并有严重感染、免疫功能疾病、恶性肿瘤、肝肾功能不全及心功能障碍患者；妊娠期、哺乳期患者；治疗和随访期间失访患者。所有研究对象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集 收集所有受试者晨起空腹静脉血各4 mL分别注入EDTA-K2的抗凝管内(2支管各2 mL)和干燥管内(1支管3 mL)，一支EDTA-K2的抗凝管常规分离血浆行静脉血浆血糖测定，干燥管常规分离血浆后取血清行胰岛素测定。葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FPG)，HbA1c检测采用高压液相色谱法。使用德国西门子ADVIACENTAUR CP全自动免疫分析仪化学发光免疫分析法测定血清胰岛素(FINS)。Homa-IR=FINS×FPG/22.5，Homa-β=FINS×20/(FPG-3.5)。

1.2.2 CpG岛预测 KCNJ11启动子区总长度为1 417 bp，通过http://www.urogene.org/cgi-bin/met在线软件预测285～910 bp(共626 bp)是一个CpG富含区域(CpG岛)，位于第一外显子下游游用“+”表示，检测5’端300 bp左右区域，见图1。

图1 预测的KCNJ11启动子区富含CpG岛区域

1.2.3 BSP-测序 取受试者静脉血1 mL，采用基因组DNA提取试剂盒(GENERAY，GK1022)抽提受试者外周血白细胞DNA，紫外分光光度法检测DNA纯度，置于-80°C冻存待用。应用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit(QIAGEN，cat：59824)按照说明书进行DNA亚硫酸氢盐修饰处理，未甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢盐修饰后变为尿嘧啶，甲基化的胞嘧啶不改变。MethPrimer软件设计甲基化KCNJ11引物(见表1)，引物由GENERAY公司合成。PCR扩增总体系50µL，加入经亚硫酸氢盐修饰的DNA模板2µL，2×PCR buffer 25µL，上下游引物各1µL，用双蒸水调整至终体积为50µL。PCR条件及设定反应程序：95°C预变性4 min；94°C变性30 s，55°C退火30 s，72°延伸40 s，运行40个循环；72°C修复延伸5 min结束反应。PCR产物以3%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，挑取阳性克隆送GENERAY公司测序。BSP扩增基因包含46个CpG位点，本研究设定原始系列中所有的CpG都是甲基化的，经亚硫酸氢盐修饰后KCNJ11修饰序列所有的CpG均不发生改变，以避免原始序列中的TG感染甲基化率，见图2。使用Vector NTI 8软件对比序列，研究发现甲基化发生在第+62位、+66位、+351位3个CpG位点上，因此，以甲基化胞嘧啶(mC)克隆数目/10×100%计算个体甲基化率。

表1 本文中所用各种引物

图2 假定检测区域CG均甲基化经亚硫酸氢钠修饰后的KCNJ11基因+62～356序列

1.2.4 QPCR检测信使RNA(mRNA) 用HiPure Blood/Liquid RNA Kit(Magen，R4163)提取外周血白细胞RNA，按Reverse Transcription System(Promega，A3500)试剂盒说明书进行逆转录。QPCR扩增总体系20µL，加cDNA模板1.5µL，GoTaq®qPCR Master Mix(Promega，A6002)10 µL，上下游引物(见表1)1 µL，用双蒸水调整至终体积为20µL。PCR条件及设定反应程序：95°C预变性120 s；95°C变性15 s，60℃ 退火延伸30 s，运行40个循环。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，采用t检验进行两样本均数的比较，多组间均数的比较采用方差分析；相关分析用Spearman相关分析，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组间启动子区域甲基化率比较 对照组与2型糖尿病组各组(A组、B组)的三个位点甲基化比率比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2、图3。对照组mRNA相对定量为(0.95±0.49)，2型糖尿病组mRNA相对定量为(1.27±0.56)，两组间mRNA表达比较，差异无统计学意义(t=1.124，P＞0.05)。

2.2 启动子区域甲基化比率与临床指标的相关性 分别对对照组、2型糖尿病A组和B组的KCNJ11启动区的三个位点CpG+62、CpG+66、CpG+351甲基化比率与mRNA、HbA1c、Homa-IR、Homa-β行相关性分析：该三个位点甲基化率在各组与mRNA、HbA1c、Homa-β均无明显相关性(P＞0.05)，CpG+62、CpG+351在各组与Homa-IR无明显相关性(P＞0.05)，CpG+66在2型糖尿病B组与Homa-IR呈负相关(r=-0.696，P＜0.05)，见图4A，CpG+62与CpG+66甲基化比率的总和在对照组、A组与Homa-β无明显相关性(P＞0.05)，在2型糖尿病B组与Homa-β呈负相关(r=-0.664，P＜0.05)，见图4B。

表2 各组间启动子区域甲基化率比较(%)

图3 各组间KCNJ11启动子区位点甲基化比率比较

图4 A-B KCNJ11启动子区域甲基化比率与临床指标的相关性

3 讨 论

2型糖尿病是成人发病型糖尿病，此类患者并未完全丧失产生胰岛素的能力，但是其胰岛素的作用效果较差[3]。2型糖尿病的病因较为复杂，一方面胰岛素分泌相对不足，另一方面则是因为患者产生了胰岛素抵抗[4]。2型糖尿病的发病除了受到环境因素的影响外，基因遗传因素也具有重要作用[5]。在2型糖尿病的易感基因的研究中，KCNJ11一直是一个热点。KCNJ11基因全长约2 kb，编码内向整流钾通道Kir6.2亚基。Kir6.2亚基主要分布于胰岛β细胞，并与磺脲受体1共同组成β细胞ATP敏感的钾通道。而Kir6.2亚基在其中组成通道中心通透孔，该通道在胰岛素分泌和作用过程中扮演着十分重要的角色，成为2型糖尿病发病机制中易感基因之一[6]。目前有大量的研究提示KCNJ11基因突变是2型糖尿病的发病机制之一，并把其发病机制的研究提升到了表观遗传学的水平[7]。但是也有国内的一些研究发现KCNJ11的E23K位点、rs5219等位点的核苷酸多态性与2型糖尿病的易感性没有显著相关性[8-9]。因此我们将研究的方向转向KCNJ1启动子区的甲基化率方面，研究是否其对胰岛β细胞的功能产生影响，进而影响胰岛素的分泌及机体对胰岛素的抵抗。Olsson等[10]报道，胰岛β细胞相关基因之一KCNJ11甲基化与胰岛β细胞mRNA表达呈负相关，而在我国目前尚无相关报道。

本研究创新性地将新发T2DM患者KCNJ11启动子区甲基化水平与其相对应的mRNA表达及应用于Homa-IR、Homa-β的评估，结果发现在研究区域的甲基化比率与其mRNA表达无明显相关性，在均有甲基化的位点-CpG+62、CpG+66、CpG+351，正常组与2型糖尿病组各组(A组、B组)的KCNJ11启动子区的这三个位点甲基化比率均差异无统计学意义(P＜0.05)，这可能是由于样本量较小的原因，也可能说明KCNJ11启动子区甲基化与2型糖尿病的易感性无关。虽然本研究样本量较小，但在其甲基化比率与上述临床相关指标的统计分析中，部分结果已具有明显统计学意义，故在2型糖尿病血糖升高患者中KCNJ11启动子区存在某些位点的甲基化率与Homa-IR、Homa-β指标呈负相关，推测可能是2型糖尿病患者启动子区的某些位点的甲基化水平变化影响了胰岛β分泌胰岛素功能，这可能与该基因某些位点突变相关[11]，而对mRNA表达影响不明显。

综上所述，2型糖尿病患者KCNJ11启动子区某些位点的甲基化率与Homa-IR、Homa-β存在负相关性。本研究旨在为2型糖尿病发病机制在表观遗传学研究的发展提供帮助，期望为今后2型糖尿病发病机制及新药的研究提供方向。本研究所用样本量较小，后续深入研究需采用较大的样本量。

[1]Rorsman P,Ramracheya R,Rorsman NJ,et al.ATP-regulated potassium channels and voltage-gated calcium channels in pancreatic alpha and beta cells:similar functions but reciprocal effects on secretion[J].Diabetologia,2014,57(9):1749-1761.

[2]Hanson MA,Godfrey KM.Genetics:Epigenetic mechanisms underlying type 2 diabetes mellitus[J].Nature Reviews Endocrinology,2015,11(5):261-262.

[3]朱琳,刘力戈.社区居民中医体质与2型糖尿病相关性研究[J].临床和实验医学杂志,2016,15(12):1169-1174.

[4]袁瑾,俞娟,崔世维.新诊断2型糖尿病患者血脂谱及胰岛素抵抗的特点[J].海南医学,2010,21(17):11-12.

[5]乔彦,谢席胜,刘瑞,等.TNFRSF4基因rs17568多态性与2型糖尿病的相关性[J].成都医学院学报,2016,11(3):313-316.

[6]王媛媛,尹立群,王泓午,等.胰岛素分泌调控基因与中国汉族人群2型糖尿病易感性的研究进展[J].中国慢性病预防与控制,2015,23(1):65-68.

[7]Phani NM,Vasudeva G,Ravishankara B,et al.Population specific impact of genetic variants in KCNJ11 Gene to type 2 diabetes:a case-control and meta-analysis study[J].Plos one,2014,9(9):e107021.

[8]陈庆隆,朱咏瑶,周敏华.东莞地区汉族人群KCNJ11基因E23K位点多态性与2型糖尿病关系[J].中华实用诊断与治疗杂志,2015,29(12):1173-1175.

[9]沈琴,李文亚,胡兴坡,等.KCNJ11和KCNQ1基因与中国人2型糖尿病的关系[J].江苏医药,2015,41(2):157-159.

[10]Olsson AH,Volkov P,Bacos K,et al.Genome-wide associations between genetic and epigenetic variation influence mRNA expression and insulin secretion in human pancreatic islets[J].PLoS Genetics,2014,10(12):e1004735.

[11]Locke JM,Hysenaj G,Wood AR,et al.Targeted allelic expression profiling in human islets identifies cis-Regulatory effects for multiple variants identified by type 2 diabetes genome-wide association studies[J].Diabetes,2015,64(4):1484-1491.

Relationship between the DNA methylation of KCNJ11's promoter and islet β-cell function in patients with type 2 diabetes.

LI Wen-chong1,ZHU Yong-yao1,LIU Rui-ke1,CHEN Yi-guang1,LIN Zhi-jian2.Department of Endocrinology1,Department of Clinical Laboratory2,The Third People's Hospital of Dongguan,Dongguan 523320,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the relationship between KCNJ11 promoter methylation and gene transcription,Homa-IR and Homa-β in patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM).MethodsA total of 15 new cases of T2DM patients,who admitted Department of Endocrinology of the Third People's Hospital of Dongguan from April 2014 to April 2015,were selected and divided into A group(5 cases of HbA1c≤9%)and B group(10 cases of HbA1c＞9%)according to the level of HbA1c,and 15 healthy subjects were included into the control group.DNA methylation level of 5'end of 300 bp in the 46 CpG loci of KCNJ11 gene promoter was determined by sulfite method,The transcriptional expression of KCNJ11 gene was measured by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The relationship between KCNJ11 promoter methylation and Homa-IR,Homa-β was analyzed.Results The methylation ratio of CpG+62,CpG+66,CpG+351 in the control group were(58±24)%,(46±17)%,(96±8)%,respectively,(60±19)%,(42±18)%,(99±7)%inAgroup,and(60±18)%,(41±20)%,(98±4)%in B group,respectively,with no significant difference between the three groups(P＞0.05).There was no significant difference in the expression of mRNA between T2DM patients(1.27±0.56)and the control group(0.95±0.49)(P＞0.05),but in the B group,CpG+66 was negatively correlated with Homa-IR(r=-0.696,P＜0.05),and CpG+62 and CpG+66 methylation sum was negatively correlated with Homa-β (r=-0.664,P＜0.05).ConclusionThe methylation of KCNJ11 promoter region in type 2 diabetic patients may be related to the insulin secretion function of islet beta cells,and involved in the morbidity of type 2 diabetes mellitus.

Type 2 diabetes mellitus(T2DM);DNAmethylation;Polymerase chain reaction(PCR);Gene

R587.1

A

1003—6350（2017）20—3287—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.20.007

东莞市科技计划项目（编号：201410515000819）

李雯翀。E-mail：elimy123@sina.com

2017-06-20)