发酵黄浆水乳酸菌的筛选及其制备工艺的研究

陈大卫+陆文琨+黄玉军+张玉律+蔡润娴

摘 要：该文以黄浆水作为培养物，研究不同乳酸菌发酵黄浆水对致病菌大肠杆菌的抑菌作用，通过单因素试验和正交试验研究具有抑菌功能的发酵黄浆水的最佳发酵条件和碳氮源组成。结果表明：嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）TY947-4黄浆水发酵液的pH较低、酸度和活菌数较高，分别为3.91、84.66°T及9.21×108CFU/mL，对大肠杆菌的抑菌能力较强，抑菌圈直径为18.13mm；S.thermophilus TY947-4发酵黄浆水的最适发酵条件为：添加1.5%的葡萄糖，0.5%的鱼粉蛋白胨及0.5%的酵母膏，接种量为6%，39℃发酵48h，对大肠杆菌的抑菌圈直径达到22mm。

关键词：乳酸菌；抑菌；发酵黄浆水

中图分类号 S816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）20-0014-05

Screening of Lactic Acid Bacteria of Fermented Yellow Serofluid and its Fermentation Conditions

Chen Dawei et al.

（Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract：The antimicrobial of lactic acid bacteria （LAB） of fermented yellow serofluid were studied，the enteropathogenic Escherichia coli （E.coli） was used as indicate bacteria，and the optimum fermentation conditions of fermented and the composition of carbon and nitrogen sources were researched by single -factortest and orthogonal test.The results showed that the pH of Streptococcus thermophilus TY947-4 fermentation liquid was low，and the acidity and the viable count of LAB was higher than other strains，whcih were 3.91，84.66°T and 9.21×108CFU/mL respectively，and the antibacterial activity of E.coli was also higher，the diameter of inhibition was 18.13mm.The optimized fermentation conditions of S.thermophilus TY947-4 of fermented yellow serofluid were 39 oC，fermented 48h and 6% inoculation amount，and carbon source and nitrogen source were 1.5% glucose，0.5% peptone and 0.5% yeast extract meal ，the diameter of inhibition E.coli was 22mm.

Key words：Lactic acid bacteria；Antibacterial；Fermented yellow serofluid

黃浆水是在豆腐加工过程中产生的副产物，含有可溶性糖类、低聚糖、大豆异黄酮、蛋白质、膳食纤维及无机盐等丰富的营养物质，由于是富营养化物质，黄浆水的化学需氧量较高，直接排放会对环境造成严重污染。目前我国对于豆腐黄浆水的综合利用，主要是回收黄浆水中的营养成分[1，2]或以其作为发酵基质，生产虾青素、维生素、曲酸、核黄素等功能性物质[3]。

随着生物技术水平的发展，天然生物抗菌剂已被越来越多的应用于食品中，对食品中的多种有害微生物均有较强的杀灭作用，能快速抑制其生长。乳酸菌作为人体肠道中重要的益生菌，具有调节肠道菌群结构、改善胃肠道功能、增强机体的抗氧化能力及免疫力等功能[4]，被广泛的应用于食品发酵，除了能够增强食品的功能性外，还可以改善食品风味，并延长食品的保质期等[5]。研究[6]还发现，应用乳酸菌发酵黄浆水不仅可以获得具有功能性的营养成分，还可以代谢异黄酮、蛋白质等物质，从而获得生产性能优越的抗菌剂。有研究[7]表明，不同的乳酸菌发酵黄浆水的产酸能力不同，不同的发酵条件、碳源、氮源及其含量也对发酵黄浆水的抑菌能力产生了较大的影响。为此，本文以黄浆水为发酵基质，筛选出发酵黄浆水产生抑菌效果较好的乳酸菌，并研究其发酵工艺，在丰富了利用黄浆水手段的同时，也为天然抑菌剂的开发利用提供理论基础。

1 试验材料与设备

1.1 试验材料 黄浆水：扬州市维扬豆制品厂；MRS液体培养基、LB培养基：北京陆桥技术有限责任公司；碳酸氢钠、氢氧化钠、过氧化氢、磷酸二氢钾、盐酸、氯化钠、无水乙醇：分析纯，均为国药集团化学试剂有限公司提供；大肠杆菌（Escherichia coli SDZC07）：扬州大学医学院提供；试验菌株：扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室分离保藏。

1.2 试验设备 JF-SX-500全自动灭菌锅：日本TOMY公司；HH-6型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；WS2-134-75培养箱：上海跃进医疗器械一厂；S-25型数显pH计：上海精密科学仪器有限公司；Legend mach1.6R高速冷冻离心机：美国塞默飞世尔科技有限公司。endprint

2 试验方法

2.1 乳酸菌的活化 将实验室保藏的乳酸菌按3%接种量接种于MRS培养基中，37℃培养24h，4℃冷藏备用。

2.2 大肠杆菌的活化 将大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃培养18h，利用平板计数法测定其活菌数，用灭菌的培养基调节其活菌浓度，使其活菌数在108CFU/mL，4℃冷藏备用。

2.3 乳酸菌的篩选 黄浆水于115℃灭菌20min后接入10%的乳酸菌，37℃培养24h，测定其pH，并参照GB 5009.239-2016[8]的方法测定其酸度，同时利用平板计数法测定乳酸菌的活菌数。采用单层琼脂平板扩散法测定发酵液的抑菌能力，取菌液浓度为108CFU/mL的大肠杆菌菌液0.20mL涂布于LB培养基平板上，待菌液固定在培养基表面后打孔，然后将黄浆水发酵液注入孔内至满孔，于37℃培养10h，观察并测量抑菌圈直径，本试验需重复3次。判定标准为：无抑菌圈为不抑菌，10～15mm为低度抑菌，15～20mm为中度抑菌，大于20mm为高度抑菌。

2.4 黄浆水的发酵条件

2.4.1 发酵温度 将乳酸菌以10%的接种量接种于黄浆水中，分别在30℃、33℃、36℃、39℃、42℃条件下培养24h。测定发酵液的抑菌活性，确定最适培养温度。

2.4.2 发酵时间 将乳酸菌以10%的接种量接种于黄浆水中，在37℃条件下分别培养24h、36h、48h、60h、72h。测定发酵液的抑菌活性，确定最适培养时间。

2.4.3 乳酸菌接种量 将乳酸菌分别以2%、4%、6%、8%、10%的接种量接种于黄浆水中，在37℃条件下培养24h。测定发酵液的抑菌活性，确定最适接种量。

2.4.4 正交试验 根据单因素试验结果，选择发酵温度、发酵时间和接种量为影响因素，利用SPSS 17.0软件中的3因素3水平正交设计，对试验结果进行分析。

2.5 碳源的确定 在黄浆水中分别添加2%和4%的蔗糖、乳糖、葡萄糖，按上述发酵条件中确定的发酵温度、时间及接种量来发酵黄浆水。测定发酵液的抑菌活性，进而确定最适碳源。

2.6 复合氮源的确定 将乳清蛋白粉、鱼粉蛋白胨及酵母膏分别以0%、0.5%、1%的添加量添加到黄浆水中，测定发酵液的抑菌活性。设计三因素三水平正交p试验，确定氮源的最优添加组合，选取的因素及水平见表1。

3 结果与分析

3.1 乳酸菌发酵黄浆水对大肠杆菌的抑制作用

3.1.1 发酵液pH、酸度以及活菌数 将乳酸菌按10%的接种量接种于灭菌的黄浆水，37℃培养24h后，测定其pH、酸度以及活菌数，结果见表2。由表2可知，12株乳酸菌的黄浆水发酵液的pH值在3.6～4.6，其中菌株978-4的pH值为3.63，显著低于其他菌株（P<0.05）；菌株TY947-4、MY087-2、LH100-1、978-4及V9的发酵液酸度均大于80°T，显著高于其他菌株（P<0.05）；而菌株TY947-4、978-4及V9发酵液的活菌数均在9.0×108CFU/ml以上，显著高于其他菌株（P<0.05）。

3.1.2 发酵液抑菌活性的测定 采用单层琼脂平板扩散法测定了12株乳酸菌的黄浆水发酵液对大肠杆菌的抑菌活性，结果见图1。由图1可知，12株乳酸菌的黄浆水发酵液对大肠杆菌均有一定的抑制作用。其中菌株TY947-4的抑菌圈直径为18.13mm，为中度抑菌，显著高于V3、LPRA-1、T2等7株乳酸菌（P<0.05）。结合3.2 发酵条件的确定

3.2.1 发酵温度、时间及接种量的确定 将乳酸菌按照不同的接种量接种至黄浆水中进行发酵，以确定接种量、发酵温度及时间，结果见图2。由图2A可知，当发酵温度在39℃时，TY947-4发酵液的抑菌圈直径最大，但在大于39℃后，抑菌能力有所下降，表明TY947-4在黄浆水中的最适发酵温度为39℃。由图2B可知，当发酵时间为48h时，TY947-4发酵液的抑菌圈直径最大，但发酵时间在大于48h后，抑菌能力有所下降，表明TY947-4在黄浆水中的最适发酵时间为48h。由图2C可知，当TY947-4接种量为6%时，TY947-4发酵液的抑菌能力最强。

3.2.2 发酵条件的正交优化 在单因素研究的基础上，采用L9（34）对培养基组成进行优化。表3为培养基组成的因素与水平设计表，正交试验结果见表4。由表4可知，发酵条件中影响抑菌能力的各因素的主次关系为C（接种量）>A（发酵温度）>B（发酵时间）。从k值得出发酵液的最佳培养条件为A2B3C2，即发酵温度为39℃，发酵时间为48h，接种量为6%。

3.3 碳源及氮源对菌株发酵液抑菌活性的影响

3.3.1 碳源的确定 分别选择蔗糖、乳糖、葡萄糖作为唯一碳源，39℃发酵48h后测定发酵液的抑菌能力，结果如图3所示。由图3可知，TY947-4在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中抑菌能力显著强于其他碳源（P<0.05），但在含4%葡萄糖的黄浆水中的抑菌能力与2%葡萄糖无显著性差异（P>0.05），由此可见2%的浓度已经达到菌株的生长需求。因此选择2%及低于2%的浓度进行进一步实验，确定培养基中最佳的碳源浓度。

3.3.2 葡萄糖添加量对菌株发酵液抑菌活性的影响 选择葡萄糖添加量分别为0.5%、1.0%、1.5%和2.0%，进一步确定最适的添加量，结果见图4。由图4可知，当葡萄糖添加量为1.5%时，抑菌圈直径最大，添加量在1.5%～2%时，抑菌圈直径逐渐下降，表明葡萄糖添加量为1.5%时，黄浆水发酵液的抑菌能力最强。

3.3.3 复合氮源对菌株抑菌活性的影响 分别将乳清蛋白粉、鱼粉蛋白胨、酵母膏作为氮源，以0%、0.5%，1.0%的添加量添加到黄浆水中，设计三因素三水平的正交试验。表5为复合氮源的因素与水平设计表，正交试验结果见表6。由表6可知，复合氮源中影响抑菌能力的各因素的主次关系为A（乳清蛋白粉）>B（鱼粉蛋白胨）>C（酵母膏）。从k值得出发酵液的最佳培养基配方为A1B2C2，即加入0.5%的酵母膏，0.5%的鱼粉蛋白胨。endprint

4 结论与讨论

本文研究表明，以黄浆水作为发酵基质的乳酸菌的产酸能力较好，对乳酸菌的抑菌能力有一定的促进作用，试验发现，乳酸菌发酵黄浆水的酸度上升和pH下降存在着较强的一致性，表明乳酸等代谢产物会引起pH的下降。试验菌株中，TY947-4的抑菌能力最強，但产酸能力并不是最高，表明除了酸性物质外，其他一些代谢物质也对抑菌产生重要的影响；乳酸菌还可以通过代谢产生CO2造成厌氧环境来抑制需氧细菌的生长，同时还可以通过增加环境中CO2的浓度来降低细胞内pH值和酶活性，并通过减弱细胞膜的传递功能来抑制一些致病菌的生长[4]；乳酸菌产生的过氧化氢能够激活过氧化氢酶-硫氰酸系统，抑制和杀灭革兰阴性菌、过氧化氢酶阳性等细菌。同时，黄浆水中的异黄酮及其代谢产物也对致病菌具有一定的抑菌效果[9]。

本研究发现，当发酵温度、发酵时间及接种量在一定的范围内会促进乳酸菌的抑菌能力，但是当温度、时间及接种量进一步增大时，反而抑制了乳酸菌的的抑菌能力，表明在发酵过程中，过多的代谢产物使得乳酸菌的生长产生了自限性[10]。试验还研究了蔗糖、乳糖及葡萄糖作为碳源对TY947-4发酵黄浆水抑菌能力的影响，结果发现，葡萄糖可以显著的提高发酵黄浆水对大肠杆菌的抑菌能力，表明葡萄糖作为碳源可以增加TY947-4代谢产物中抑菌物质的产生。活菌数对代谢产物有较大的影响，有研究表明乳清蛋白粉、蛋白胨及酵母膏等氮源对嗜热链球菌的促生长作用具有一定的特异性[11]。本文研究发现，0.5%的酵母膏和0.5%的鱼粉蛋白胨作为TY947-4的复合氮源发酵的黄浆水抑制大肠杆菌的能力较强，表明TY947-4代谢0.5%酵母膏和0.5%鱼粉蛋白胨产生的抑菌物质较多。接种6%的S.thermophilus TY947-4至黄浆水中，并添加1.5%的葡萄糖、0.5%的酵母膏及0.5%的鱼粉蛋白胨，在39℃发酵48h，其对大肠杆菌的抑菌能力较高。本文在体外筛选并优化了乳酸菌发酵黄浆水抑制大肠杆菌的发酵条件，其在肠道内的抑菌效果还需要在体内试验中进一步验证。

参考文献

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[11]白凤翎.蛋白水解物促乳酸菌增殖及高密度培养体系研究[D].北京：北京林业大学，2010. （责编：张宏民）endprint