九里香叶对去卵巢大鼠体积骨密度、血钙、血磷、碱性磷酸酶、骨组织形态学的影响

文 娱 李晓晖 尤文质 郑启忠 高 海 张秋萍 彭清华

(1 厦门市中医院药学部，厦门，361009； 2 厦门市中医GC办公室，厦门，361009； 3 厦门市中医院病理科，厦门，361009； 4 厦门市中医院科教科，厦门，361009)

九里香叶对去卵巢大鼠体积骨密度、血钙、血磷、碱性磷酸酶、骨组织形态学的影响

文 娱1李晓晖2尤文质1郑启忠3高 海4张秋萍2彭清华1

(1 厦门市中医院药学部，厦门，361009； 2 厦门市中医GC办公室，厦门，361009； 3 厦门市中医院病理科，厦门，361009； 4 厦门市中医院科教科，厦门，361009)

目的：观察九里香叶对去卵巢大鼠体积骨密度、血钙、血磷、碱性磷酸酶、骨组织形态学的影响。方法：取60只SPF级SD雌性大鼠，通过切除双侧卵巢复制骨质疏松模型。术后7 d分组给药。模型组：生理盐水(0.4 mg/kg·d)；对照组：生理盐水(0.4 mg/kg·d)；戊酸雌二醇组：0.4 m g/kg·d；九里香高剂量组：200 mg/kg·d；九里香中剂量组：100 mg/kg·d；九里香低剂量组：50 mg/kg·d。连续给药90 d。给药结束后，测定大鼠体积骨密度，采用电极法测定血钙；速率法测定血磷、碱性磷酸酶。大鼠右侧股骨HE染色，计量骨小梁平均宽度、骨小梁面积百分率。结果：与对照组比较，模型组大鼠体积骨密度明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组大鼠血钙、碱性磷酸酶明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，血磷无差异；模型组大鼠骨小梁平均宽度及骨小梁面积百分率明显降低，差异有统计学意义。与模型组比较，九里香叶高剂量组大鼠体积骨密度明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；九里香叶高剂量组大鼠血钙明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，血磷无统计学意义；九里香叶低剂量组大鼠碱性磷酸酶明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；九里香叶高剂量组骨小梁平均宽度及骨小梁面积百分率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：九里香叶影响去卵巢大鼠骨质疏松体积骨密度、血钙、碱性磷酸酶、骨小梁平均宽度及骨小梁面积百分率变化，具有抗骨质疏松作用。

九里香；骨密度；血钙；血磷；碱性磷酸酶；骨组织形态学

九里香为芸香科九里香属植物，主要分布在我国福建、广东、广西、海南、台湾等省区，全年均可采收，其气香，味苦、辛，有麻舌感[1]。早在多年前，我国南方地区就已经将九里香作为一种民间用药，其疗效得到广泛认可[2]。它具有行气活血、散瘀止痛、解毒消肿等功效[3]。实验证实，黄酮是九里香的主要活性成分之一，尤以叶子中的含量最高[4]，九里香叶作为药用部位合理[5]。研究证实，黄酮类化合物具有明确的抗骨质疏松作用[6]。九里香叶天然存在的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收。因此本课题通过切除SD大鼠双侧卵巢复制骨质疏松模型，观察九里香叶对去卵巢大鼠体积骨密度、血钙、血磷、碱性磷酸酶、骨组织形态学的影响，从而明确九里香叶是否具有抗骨质疏松作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SD大鼠，2月龄，体重(250±20)g，SPF级实验动物，由厦门大学实验动物中心提供，合格证号SYXK(闽)2013-0006。

1.1.2 药物 戊酸雌二醇片：拜耳医药保健有限公司广州分公司分包装，批号：203A2，规格：1 mg×21片；九里香叶由厦门市中医院制剂室主任尤文质副主任中药师鉴定。

1.1.3 试剂与仪器 碱性磷酸酶检测试剂:美国贝克曼库尔特有限公司，批号：Z510231，规格：2×400T；磷(PHOSm)检测试剂：美国贝克曼库尔特有限公司，批号：Z509208，规格：R1：2×200 mL，R2：2×1 800 mL；电子天平：HXW-Ⅱ(恒恊电子有限公司)；全自动生化分析系统：unicel dxc800(美国贝克曼库尔特有限公司)；半自动石蜡切片机：RM2245(德国莱卡仪器公司)；生物显微镜：BX43(奥林巴斯有限公司)；BI-2000医学图像分析系统：成都泰盟有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 取SPF级SD雌性大鼠(2月龄)60只，大鼠予以2%戊巴比妥钠(0.0002 mL/g)腹腔注射麻醉，术前腹腔注射青霉素(5万U/kg)，预防感染。无菌条件下摘除双侧卵巢，关闭腹腔，对照组动物同法切除卵巢旁同样大小的脂肪组织。造模7 d后，分组及给药。实验动物随机分为6个组，各组均为10只动物。

1.2.2 给药方法 灌胃给药，1次/d，连续90 d。模型组(OVX)：生理盐水(0.4 mg/kg·d)；对照组：生理盐水(0.4 mg/kg·d)；戊酸雌二醇组：0.4 mg/kg·d，(戊酸雌二醇用0.5%的羧甲基纤维素钠溶液配制成40 mg/L的混悬液)；九里香高剂量组：200 mg/kg·d；九里香中剂量组：100 mg/kg·d；九里香低剂量组：50 mg/kg·d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 体积骨密度测定 实体股骨标本及其不同骨段骨密度值测量：以电子天平测量实体股骨标本及其不同骨段的重量，以“溢出法“测量股骨及其不同骨段的体积。

1.2.3.2 血钙、血磷、碱性磷酸酶的测定 末次给药后次日，断头取血5 mL置入无抗凝剂的试管中。3 000 r/min，离心15 min，分离血清。采用电极法测定血钙，速率法测定血磷、碱性磷酸酶。

1.2.3.3 骨组织形态学观察 取约1.5 cm长，含股骨头的右侧股骨浸于10%中性福尔马林中固定，PBS液充分漂洗，再经过10%EDTA、PBS(PH 7.4)4 ℃下脱钙3～4周，隔天换液1次；脱钙完成，蒸馏水冲洗，70%，80%，90%，95%，无水乙醇梯度脱水各4 h；二甲苯透明12 h，浸透液浸透，石蜡包埋，纵向连续切片，厚4 μm。每个标本取一张切片进行HE染色，作组织学检查。光镜下观察骨组织病理学改变，用BI-2000医学图像分析系统进行骨组织形态学分析，每个标本随机选取5个视野，取其均值，计量：1)骨小梁平均宽度；2)骨小梁面积百分率(%)=骨小梁面积/总组织面积×100%。

2 结果

2.1 九里香叶对去卵巢大鼠体积骨密度的影响 与对照组比较，模型组大鼠体积骨密度明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，戊酸雌二醇组、九里香叶高剂量组大鼠体积骨密度明显增高，差异有统计学意义，P<0.05。见表1。

2.2 九里香叶对去卵巢大鼠血钙、血磷、碱性磷酸酶的影响 与对照组比较，模型组大鼠血钙、碱性磷酸酶明显降低，差异有统计学意义，P<0.05。与模型组比较，九里香叶高剂量组大鼠血钙明显增高，差异有统计学意义，P<0.05；与模型组比较，九里香叶低剂量组大鼠碱性磷酸酶明显降低，差异有统计学意义，P<0.05。见表2。

表1 九里香叶对大鼠体积骨密度的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，▲P<0.01，与模型组比较△P<0.05

表2 九里香叶对大鼠血钙、血磷、碱性磷酸酶的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，▲P<0.01，与模型组比较△P<0.05

2.3 九里香叶对去卵巢大鼠骨组织形态学的影响

2.3.1 光镜下观察骨小梁 对照组：骨小梁密集、排列整齐、结构呈网状、连接紧密、骨髓腔较小；模型组：骨小梁稀疏、断裂、排列紊乱、大部分不能连接成网状、骨髓腔明显扩大；戊酸雌二醇组：骨小梁排列紧密、连接成网状、骨髓腔较小；九里香叶高剂量组：骨小梁明显增粗、连接成网状；九里香叶中剂量组：骨小梁较粗、骨髓腔较小；九里香叶低剂量组：骨小梁较粗、有断裂、骨髓腔较小。见图1至图6。

2.3.2 与对照组比较，模型组骨小梁平均宽度及骨小梁面积百分率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，九里香叶高剂量组骨小梁平均宽度及骨小梁面积百分率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

3 讨论

植物性雌激素可模拟雌激素作用，目前已成为国内外雌激素天然替代品研发的热点。曾发挥[7]等学者证实九里香可能通过雌激素样作用发挥保护软骨作用。本研究切除大鼠双侧卵巢，使雌激素水平降低，诱发女性绝经后相似的骨量丢失和骨结构改变，建立骨质疏松症的实验模型[8-9]。探讨九里香叶预防骨质疏松作用。

体积骨密度是由骨量和骨大小双重因素决定的，骨体积对骨密度的高低起着重要的作用，体积骨密度更加符合骨力学强度变化的骨质疏松诊断指标[10]。实验结果表明，大鼠去卵巢后，体积骨密度明显降低，九里香叶高剂量组明显提高大鼠体积骨密度，差异有统计学意义(P<0.05)，说明九里香叶高剂量给药可改善骨力学指标变化，对骨质疏松有一定的防治作用。

图1 模型组HE×100 图2 对照组HE×100

图3 戊酸雌二醇组HE×100 图4 九里香叶高剂量组HE×100

图5 九里香叶中剂量组HE×100 图6 九里香叶低剂量组HE×100

组别骨小梁平均宽度/μm骨小梁面积百分率/%对照组44.75±1.9021.54±1.36模型组41.02±1.08▲19.16±1.61*戊酸雌二醇组42.68±1.09△20.86±1.02△九里香叶高剂量组42.39±1.16△20.90±1.01△九里香叶中剂量组41.02±1.4019.13±1.19九里香叶低剂量组40.66±1.0419.89±0.82

注：与对照组比较，*P<0.05，▲P<0.01，与模型组比较△P<0.05

骨无机质主要含有钙(Ca)、磷(P)等矿盐，是构成骨的硬度的主要成分，血清中Ca、P的检测可间接反映骨矿物质变化情况。本研究中，九里香叶高剂量组血清Ca含量较模型组明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，钙是维持骨量的基本物质[11]，提示九里香叶可影响骨矿代谢[12]。P含量各组之间比较差异均无统计学意义。血磷水平的稳定是骨生长和矿化的必要条件之一[13]。本实验结果提示九里香叶对血磷水平无调节作用。碱性磷酸酶(ALP)主要存在于成骨细胞[14]，骨代谢速率增加的代谢性骨病血清ALP显著升高[15]。本研究中，九里香叶中、低剂量组血清ALP含量较模型组显著降低，其中九里香叶低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)，提示九里香叶可影响骨代谢，没有剂量依赖性。其机制可能与九里香叶具有雌激素样活性，降低骨转换率，间接减少骨吸收有关。ALP是反映成骨细胞的重要标志[16]，提示九里香叶可能也增加成骨细胞活性。

骨组织形态计量学可将二维图像展示的骨组织和细胞结构进行定量分析，为骨结构、骨形成及骨吸收提供客观数据[17]。可用以分辨骨质疏松的程度和性质[18]。本实验结果显示，去势后小鼠骨小梁平均宽度、骨小梁面积百分率有明显下降，九里香叶高剂量使去势后小鼠骨小梁平均宽度、骨小梁面积百分率均明显提高，说明骨的内部结构得到很好的恢复，对骨质疏松程度有明显的改善作用。

综上所述，九里香叶对去卵巢大鼠体积骨密度有改善作用、影响骨矿物质的代谢、对血液生化指标有一定的改善作用、可明显影响骨组织形态学，但不呈剂量相关性。表明九里香叶具有预防骨质疏松作用，但具体作用机制还需进一步探讨。

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EffectsofMurrayaPaniculatLeafonVolumetricBoneMineralDensity,Bloodcalcium,BloodPhosphorus,Alkalinephosphatase,boneHistomorphologyinOvari-ectomizedRats

Wen Yu1, LI Xiaohui2,You Wenzhi1, Zheng Qizhong3, Gao Hai4, Zhang Qiuping2, Peng Qinghua1

(1PharmacyDepartment,XiamenHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xiamen361009,China; 2DrugClinacalTrialInstitution,XiamenHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xiamen361009,China; 3DepartmentofPathology,XiamenHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xiamen361009,China; 4DepartmentofScienceandEducation,XiamenHospitalofTraditionalChineseMedicine,Xiamen361009,China)

Objective:To observe the effect of Murraya Paniculat leaf on volumetric bone mineral density, blood calcium, blood phosphorus, Alkaline phosphatase, bone histomorphology in ovari-ectomized rats.MethodsA total of 60 SPF SD female rats were taken as models by removing bilateral ovaries. After 7 days of operation, all rats were divided into six groups：model group (normal saline, 0.4 mg/kg·d), control operation group (normal saline, 0.4 mg/kg·d), Estradiol Valerate group(0.4 mg/kg·d), Murraya Paniculat leaf high dose group (200 mg/kg·d), Murraya Paniculat leaf middle dose group (100 mg/kg·d) and Murraya Paniculat leaf low dose group (50 mg/kg·d). Drugs were given once a day for 90 days. Using electrode analysis to measure volumetric bone mineral density of rats and velocity method to measure blood calcium and blood phosphorus and alkaline phosphatase. Use HE staining on the right side of the femur of rats, then measured the average width and trabecular bone area percentage.ResultsCompared with the control group, volumetric bone mineral density of model group rats were reduced (P<0.05), blood phosphorus and Alkaline phosphatase of model group rats were lower, and the difference is significant (P<0.05), also, the average width and trabecular bone area percentage of model group rats were lower (P<0.05). No difference was found in blood phosphorus. Compared with model group, volumetric bone mineral density and blood calcium and the average width and trabecular bone area percentage were higher in Murraya Paniculat leaf high dose group (P<0.05). No difference was found in blood phosphorus. Also, alkaline phosphatase in Murraya Paniculat leaf low dose group was lower with significant difference (P<0.05).ConclusionMurraya Paniculat leaf could influence volumetric bone mineral density, blood calcium, blood phosphorus, alkaline phosphatase, the average width and trabecular bone area percentage in ovari-ectomized rats. It has anti-osteoporosis effect.

Murraya Paniculat; Bone mineral density; Blood calcium; Blood phosphorus; Alkaline phosphatase; Bone histomorphology

厦门市科技局计划项目(3502Z50154056)

文娱(1977.06—)，女，硕士，主管药师，临床药师，研究方向：中药药理，Tel:(0592)5574312，E-mail:xiaanwen@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.038

(2016-09-01收稿 责任编辑：徐颖)