水稻淀粉合成候选基因OsAGPL3与淀粉相关性状的关联分析

邹德堂，赵广欣，孙 健

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

水稻淀粉合成候选基因OsAGPL3与淀粉相关性状的关联分析

邹德堂，赵广欣，孙 健

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

以不同地理来源77份水稻品种组成关联作图群体，对水稻淀粉合成相关候选基因OsAGPL3作序列变异分析，在考虑群体结构影响基础上，利用连锁不平衡结构分析和关联分析揭示该基因与淀粉相关性状关系，发掘与直链淀粉含量、支链淀粉含量、胶稠度和糊化温度相关优异等位变异。OsAGPL3基因多态性分析表明，在编码区和非编码区内共发现200个SNP和44个Indel，LD衰减距离为1 260 bp（R2=0.1），11个多态性位点与淀粉相关性状存在显著关联，其中5个位点可引起氨基酸改变，试验群体可分为12种单体型。

水稻；淀粉；OsAGPL3基因;关联分析

水稻是重要粮食作物，其品质性状成为研究重点[1-2]。蒸煮食味是评价稻米品质主要指标之一。淀粉作为重要营养成分，其组成和结构是影响蒸煮食味主要因素，决定稻米品质[3-5]。

淀粉合成是复杂过程，与稻米淀粉合成相关酶主要有5大类，包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉分支酶（SBE）、颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SSS）和脱分支酶（DBE），各类酶存在相应同工型，由20个基因编码，在合成不同阶段每个基因作用不同[6-11]。其中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（简称AGP酶），是水稻中催化淀粉合成第一阶段关键酶，对蒸煮食味起决定作用[12]。Bao等研究表明，水稻AGP基因家族主要由四个大亚基（OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPL3和OsAGPL4）和两个小亚基（OsAGPS1和OsAGPS2）组成[12]，对比序列，发现其同源性较高，但在AGpase中功能不同：大亚基是酶调节中心，小亚基是酶活性中心[13]。姜丽娜等证明AGP基因表达促进淀粉积累[14]；Lee等证实OsAGPL2、OsAGPS2在胚乳中特异性表达[15]；Huang等发现OsAGPL4可能是源组织和库组织中次要亚基[16-17]。

单核苷酸多态性（SNP）是基因组序列中单个碱基对变化或小片段插入缺失引起的多态性。存在于基因组各个区域，根据位置可分为基因编码区SNP和非编码区SNP两类，基因编码区变异可能导致编码氨基酸发生变化，引起蛋白质序列改变，造成蛋白质功能差异。例如，位于Wx基因第4外显子处A762突变为G762，天冬氨酸变为甘氨酸；位于第6外显子中A1132突变为C1132，酪氨酸变为丝氨酸[18-20]。

关联分析技术应用自然种质群体，将目标性状表型值同基因多样性结合，挖掘具有特定功能等位基因位点[21]。较传统连锁分析，具有更高分辨率、挖掘并分析更多优势等位基因和无需构建专门作图群体优势[22-24]。Thornsberry等发现与玉米开花期相关的5个SNP和4个Indel，首次在植物中应用关联分析技术[25]。

Huang等从水稻全长cDNA文库中鉴定6个克隆，编码腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶6个亚基，分别是OsAGPS1、OsAGPS2、OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPL3和OsAGPL4，其中OsAGPL3基因在种子发育阶段表达并直接影响淀粉累积[16]。OsAGPL3基因位于水稻第5条染色体上，基因全长5 484 bp，具有399 bp的5'非翻译区（5'UTR），含有13个内含子和14个外显子，还有441bp 3'UTR。因此，本研究将OsAGPL3作为目标基因，通过对77份不同地理来源水稻自然群体OsAGPL3基因深度测序，将群体结构作为协变量，测量与淀粉相关主要性状（直链淀粉含量、支链淀粉含量、糊化温度和胶稠度），与目标基因作候选基因关联分析，挖掘OsAGPL3基因中与淀粉相关理化特性关联SNP及Indel突变，为改良水稻品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以77份具有广泛地理分布的粳稻品种作为本试验材料（见表1），由中国农业科学院作物科学研究所、黑龙江省农业科学院、辽宁省农业科学院和东北农业大学水稻研究所提供。2016年在东北农业大学阿城实验实习基地开展田间试验，4月16日播种，5月20日插秧，双行区，行长2米，行距30厘米，穴距10厘米，3次重复，水肥病虫害管理同一般大田管理。

1.2 DNA提取和PCR产物测序

采用CTAB法[26]提取DNA，以NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中OsAGPL3参考基因组为模板，使用Primer Premier5.0软件分四段设计引物。

以供试材料全基因组DNA为模板，采用康为世纪公司2×Taq MasterMix作PCR扩增，反应体系为50 μL，其中包含2 μL（40 ng·μL-1）DNA、5 μL上游引物（10 μmol· L-1）、5 μL下游引物（10 μmol·L-1）和25 μL 2×Taq MasterMix（Taq DNA酶、PCR Buffer、Mg+、dNTPs和13 μLddH2O）。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 90 s，35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。直接测序经过回收纯化的PCR片段，每个试样重复3次。

1.3 淀粉相关理化特性测定

1.3.1 淀粉含量测量

双波长法测定直链淀粉含量与支链淀粉含量[27]，绘制标准曲线，将样品放入烘干箱至恒重。粉碎过60目筛，乙醚脱脂，称取脱脂样品约0.1 g，加0.5 mol·L-1KOH溶液10 mL，35℃水浴中振荡15 min，蒸馏水定容至50 mL后静置。从中取出2.5 mL作为样品测定液，2.5 mL作为样品空白液，均加入25 mL蒸馏水，调节pH至3.5，加碘试剂0.5 mL于样品测定液中，均定容至50 mL混匀，静置20 min后，以空白液为对照，用2 cm比色杯，分别在波长620、430、550、730 nm下测定光密度值为Eλ1、Eλ2、Eλ3、Eλ4，通过计算：ΔE直=Eλ2-Eλ1，ΔE支=Eλ4-Eλ3分别代入直链淀粉标准曲线和支链淀粉标准曲线，测定两种淀粉含量。

表1 77份材料名称与来源Table 1 Name and source of the 77 accessions

表2 基于OsAGPL3基因序列引物设计Table2 Primer design based on OsAGPL3 gene sequence

1.3.2 胶稠度测量

取过0.15 mm孔径筛后精米粉0.10 g放入试管内，加入0.20 mL百里酚蓝指示剂，振荡至完全分散。再加入2.0 mL 0.20 mol·L-1氢氧化钾溶液，再次振荡。用玻璃球盖住试管口，放入水浴锅内，米胶高度约在试管长度2/3处，8 min后取出试管，常温下冷却5 min。再放入冷水中20 min。常温下，将试管平放在操作台上。1 h后测量冷胶前沿至试管底长度即为样品胶稠度（mm）[28]。

1.3.3 糊化温度测量

在每个方盒内放入6粒成熟饱满精米，分别加入10.0 mL 1.70%氢氧化钾溶液，米粒分布均匀后加盖。放入30±2℃的恒温箱内约23 h，取出后逐粒观察米粒分解情况，作分级记录，标准见表2[28-29]。

表2 稻米碱消值评价标准[27]Table 2 Evaluate standard for rice alkalidigestion value

1.4 群体结构分析

根据www.gramene.com网站微卫星数据库，选取1 000对SSR标记，由上海生工生物工程有限公司合成，随机选取20个材料作引物筛选，共选出154对均匀分布于水稻12条染色体并且多态性好、分辨性强引物。PCR产物经6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法检测，拍照记录[30]。等位基因根据带型依次赋值1～9，运用Structure 2.3.4软件[31]，采用混合模型分析。burn-in循环10 000次，MC重复100 000次，K值设为1～10，每个值计算5个重复，得出lnP（D）值和△K值，计算Q矩阵，每份材料以Q≥0.65为阈值将其划入相应亚群。

1.5 多态性检测

使用 Clustal X[32]软件序列比对OsAGPL3基因，获得PHYLIP格式文件。用 DNAsp 5.0[33]软件计算Tajima's D值，TASSEL[34]软件作单核苷酸多态性分析和连锁不平衡（LD）分析。

1.6 关联分析

基于OsAGPL3序列对目标群体作关联分析，选取TASSEL软件一般线性模型，以每个个体Q值作为协变量作回归分析，当显著水平（P＜0.05）时，认为该位点与目标性状显著关联。

2 结果与分析

2.1 群体结构分析

分析77个品种群体结构，用STRUCTURE软件分析最佳K值，K=3时,符合似然值最大。如图1所示，按照K=3将该群体分为3个亚群，第1个亚群含有44个品种，第2个亚群含有16个品种，第3个亚群有17个品种。

2.2OsAGPL3基因多态性

OsAGPL3基因多态性分布见表3。

图1 77份材料在3个亚群中分布Fig.1 Model-based cluster membership for 77 in three groups

表3 OsAGPL3基因序列多态性分布Table 3 Polymorphism of OsAGPL3 sequences

表3中，77个品种OsAGPL3基因在5 484 bp范围测序，除去5'UTR和3'UTR区域，其余4 644 bp内共发现200个SNP和44个Indel，平均每23 bp有1个SNP，每106 bp有1个Indel，SNP发生频率明显高于Indel。在编码区1 560 bp中，全部均为SNP，共17个，其频率为10.9 SNP·kb-1；在非编码区3 084 bp中，SNP加上Indel共227个，其频率为73.61 SNP·kb-1。本研究中SNP和Indel主要发生在内含子区域。在测到的SNP中，编码区共有7个转换、10个颠换，转换与颠换比例为0.7，17个多态性位点中，多态性位点为非同义突变有14个，多态性位点为同义突变仅3个。

统计基因序列多样性以核苷酸多样性π值和核苷酸多态性θ值为指标。其中，衡量群体突变率参数为θ值，而衡量同一位点不同序列之间差异为π值。由于π和θ变化趋势一致，主要分析π值变化。在前2 488 bp范围内存在较高多样性，π值先从0.0179升至0.0216，再大幅降至0.0117，然后稳点升至0.0136与0.0175；在随后627 bp内π值大幅降至0.0038，再迅速升至0.0155，然后上升至0.0208后再大幅降至0.0032，形成明显拐点；而π值在其后1 448 bp内波动较大，呈现波浪式变化趋势，出现多拐点，直到最后734 bp趋近稳点，总体π值在0.0223～0.0032，且编码区核苷酸多态性比非编码区低。整个OsAGPL3基因Tajima'D值为-2.73854，P＜0.001，达到显著水平。

2.3OsAGPL3基因连锁不平衡结构分析

对OsAGPL3基因序列多态性作位点间连锁不平衡结构分析（见图2），用不同颜色表示每对多态性位点之间r2值及Fisher精确检验P值（显著性），连锁不平衡现象越明显颜色更偏向红色，图左下角为P值，右上角为r2。由图可知，整个区域分散分布较弱LD结构，当中明显的（r2＞1.0）有2个，分别是3715～3721和3715～3722。

图2 OsAGPL3基因多态性位点间连锁不平衡(*表示显著性位点)Fig.2 Linkage disequilibrium between pairs of OsAGPL3 sequence polymorphic loci(*significant loci)

检测OsAGPL3基因LD衰退程度，以r2为衡量指标，以1 260 bp为分界线，1 260 bp后迅速 衰退。

2.4OsAGPL3基因与表型性状关联分析

将4个表型性状与OsAGPL3基因序列多态性位点关联分析表明（见表4），共有11个位点与表型性状发生关联，其中内含子有5个位点形成关联，3744（A/C）、4306（G/A）2个位点与GC关联，4271（C/T）、4297（T/C）2个位点与APC关联和4288（C/A）1个位点与AC关联；外显子有6个位点形成关联，3829（C/G）、4316（A/G）两个位点与GC关联、4318（T/G）1个位点与APC关联，2647（G/T）、2664（T/C）、3663（A/C）3个位点与AC关联。

根据淀粉相关性状与多态性位点间关联性分析及各位点贡献率，选取与性状显著关联（P＜0.05）位点（位点2647、2664、3663、3744、3829、4271、4288、4297、4306、4316、4318）将群体分为12种单体型（见表5）。

表4 多态性位点Table 4 Polymorphic loci

表5 OsAGPL3基因单体型Table 5 Haplotypes of OsAGPL3 gene

3 讨论与结论

蒸煮食味品质受外界环境影响及基因调控[35]。淀粉合成相关基因变化影响水稻蒸煮食味品质。基因功能改变或丧失一般因某个或几个位点突变引起。Umemoto等发现OsSSⅡa基因中5个变异功能性位点，其中一个SNP导致氨基酸编码变化，靠近C末端两个SNP导致氨基酸改变，可能是引起酶活性改变关键因素[36]。相对于本试验中与OsAGPL3基因相关联中11个SNP，其中5个SNP引起氨基酸改变，可能是造成淀粉含量差异原因。因此，候选基因关联分析处理基因多态性可为水稻分子标记辅助育种提供有价值信息，李钊等应用关联分析挖掘发现33个SNP和9个Indel与胚性愈伤组织形成能力显著相关[37]；杨泽峰等发现玉米ZmSSⅡa基因编码区具有24个SNP，将该基因划分成9种编码区单倍型，编码7种ZmSSⅡa蛋白质[38]；Hao等在大豆基因IFS1中发现与SMV SC-7抗性显著相关SNP 2个，其中1 902 bp位点出现在抗叶病材料中，说明IFS1基因1 902 bp“C/T”变异是与SC-7抗病性显著相关功能性位点，可开发成分子标记[39]。

Yan等认为丰富遗传多样性可促进作物改良[40]。本研究结果表明，OsAGPL3基因具有较高核苷酸多样性水平，基因序列中共发现244个多态位点，其中包含200个SNP和44个Indel。平均每23.22 bp出现1个SNP，平均每105.55出现1个Indel，高于Umemoto等研究结果[36,41-42]，可能与所选材料具有相对广泛地理来源有关。与Mishra等研究结果一致，多数SNP存在于内含子，虽然未产生氨基酸序列变化，但内含子中SNP会引起编码蛋白质结构变化，适应不同气候环境并满足各种育种要求[42-44]。利用OsAGPL3序列中SNP位点作 Tajima'D测验，其Tajima'D值为-2.73854，达到极显著水平，表明OsAGPL3基因可能受负选择作用而保持较低比率突变，或有利等位基因受到强烈正向选择，由于搭载效应产生较多低频突变，Tajima'D值为负值。

本研究中OsAGPL3基因连锁不平衡，在1 260 bp附近衰退到R2=0.1水平，与Remington等研究玉米LD衰退距离1.5 kb结果一致[45]。在分析序列11个SNP位点中，位点2664碱基变异为T/C，编码氨基酸无变化，属于同义突变；位点2647、3663、3829、4316和4318碱基均导致氨基酸变化，碱基变化分别为G/T、A/C、C/G、A/G、和G/T，相应氨基酸变化为Glu/Asp、Asp/Ala、Ser/Cys、Lys/Glu和 Lys/Asn，其中2647和2663可能是导致直链淀粉含量变化关键位点，4318可能是导致支链淀粉含量变化关键位点，3829和4316可能是导致胶稠度变化关键位点。非同义突变可引起氨基酸变化，影响蛋白质功能，但同义突变无法改变氨基酸，几乎不影响基因功能，发生氨基酸变异几个多态性位点是基因功能改变主因，但该调控是否通过改变蛋白质结构改变其功能，需进一步研究。推测仅基于核酸序列变化，OsAGPL3基因在其他过程中是否受其他因素调控，产生蛋白在一级乃至高级结构上是否有差异，尚需进一步验证。

OsAGPL3基因比对全长4 644 bp区间内共发现200个SNP和44个Indel，在整个序列内LD水平较低，有两对明显连锁不平衡位点，分别是3715～3721和3715～3722，并且在1 260 bp处R2=0.1水平。OsAGPL3基因中有4个多态性位点与直链淀粉含量相关联；有3个多态性位点与支链淀粉含量相关联；有2个多态性位点与胶稠度相关联。

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Association analysis on candidate gene OsAGPL3 involved in synthesis of rice starch and starch related traits/

ZOU Detang,ZHAO Guangxin,SUN Jian
（School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Association mapping population of 77 rice cultivars from different geographical sources was used.Gene sequence variation of candidate gene OsAGPL3 related to rice starch synthesis was analyzed.Based on the influence of population structure,the linkage disequilibrium analysis and association analysis revealed the relationship between OsAGPL3 gene and starch-related traits,and revealed related excellent allelic variation associated with amylose content,amylopectin content,gel consistency and gelatinization temperature.The polymorphism analysis of OsAGP L3 gene showed that there were 200 SNPs and 44 Indels in the coding and non-coding regions,and LD attenuation distance was 1 260 bp(R2=0.1).There were significant relationship between 11 polymorphic and starch-related traits,among which five loci caused a change in amino acids,and the population was divided into 12 haplotypes.

rice；starch；OsAGPL3 gene;association analysis

S331

A

1005-9369（2017）09-0001-10

时间 2017-10-19 17：14：29 [URL]http：//kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20171019.1714.008.

邹德堂,赵广欣,孙健.水稻淀粉合成候选基因OsAGPL3与淀粉相关性状的关联分析[J].东北农业大学学报,2017,48(9)：1-10.Zou Detang,Zhao Guangxin,Sun Jian.Association analysis on candidate gene OsAGPL3 involved in synthesis of rice starch and starch related traits[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(9)：1-10.(in Chinese with English abstract)

2017-07-03

黑龙江省重大科技招标项目（GA14B102-02）

邹德堂（1965-），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为水稻遗传育种。E-mall：zoudt@163.com