HPLC-FLD测定水中联苯胺的方法研究

张秀蓝，郭 婧，任立军，朱超飞，杨文龙，刘金林，吴忠祥，董 亮，杜 兵

国家环境分析测试中心,国家环境保护二英污染控制重点实验室,北京 100029

HPLC-FLD测定水中联苯胺的方法研究

张秀蓝，郭 婧，任立军，朱超飞，杨文龙，刘金林，吴忠祥，董 亮，杜 兵

探讨了利用液相色谱分离,荧光检测器测定地表水中联苯胺的可行性。前处理方法对比验证了液液萃取法和固相萃取法。水样在碱性条件下(pH=11～12)进行提取,当提取体积为1.0 L时,液液萃取液相色谱荧光法检测,方法检出限为1.4 ng/L,定量下限为5.5 ng/L；固相萃取液相色谱荧光法检测，方法检出限为0.9 ng/L,定量下限为3.6 ng/L。分别对地表水、生活废水、工业废水3种不同水体进行基体加标试验，加标浓度为10.0、40.0、80.0 ng/L。结果显示, 对于3种不同基体和不同加标浓度的水样, 两种方法均有较好的准确性和重现性,方法回收率为80%～120%, 相对标准偏差均小于20%, 满足《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)中对联苯胺的监测需求。

水体; 固相萃取法; 液液萃取法; 液相色谱分离；荧光测定; 联苯胺

Abstract:Due to the limiting value of benzidine in water, high performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD) was employed to try to meet the monitoring demand. For the pretreatment, two classic methods—both liquid-liquid extraction and solid-phase extraction, were verified and compared. Under the condition of basic (pH=11-12), benzidine was extracted by methylene chloride from 1 L water, and detected by HPLC-FLD, the method detection limit (MDL) was 1.4 ng/L, and the quantitative limit was (QL) 5.5 ng/L; With the same instrument conditions, the MDL and QL were 0.9 and 3.6 ng/L for solid phase extraction method. In order to test the accuracy and precision of these two methods, three kinds of matrix spiking were proceeding. While, the water types were surface water, wastewater and industrial wastewater, and the standard were added 10.0, 40.0 and 80.0 ng/L, respectively. According to the results, for both methods had good accuracy and reproducibility, recoveries were between 80%-120%, and relative standard deviations were less than 20%. It’s confirmed that HPLC-FLD was an effective way to monitor benzidine in water.

Keywords:water;solid phase extraction;liquid-liquid extraction;liquid chromatographyseparation;fluorescence detection;benzidine

联苯胺(图1)是4,4′-二氨基联苯的俗称, 国际癌症研究机构(IARC)将其列属于第一类致癌物质。我国对联苯胺的水环境浓度要求严苛，《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)规定地表水中联苯胺限值为0.000 2 mg/L[1]。检测方法参考《水和废水标准检验法》(第15版)[2], 气相色谱法, 最低检出限为0.000 2 mg/L。联苯胺的检测方法还包括：分光光度法[3], 检出范围在0～4.0 mg/L; 液相色谱法[4], 检出限为0.14 ng/mL(即0.14 μg/L); 液相色谱串联质谱法[5], 检出限为0.09 μg/L。上述方法中仅有液相色谱串联质谱法可满足我国对联苯胺的要求。虽然，国内外已建立或正在建立关于苯胺类的标准方法，但均未涉及联苯胺的检测[6-8]

常规GC-FID法，前处理复杂，选择性差，检出限与限值要求一致[1-2]。液相色谱串联质谱法试验成本高且设备昂贵，在日常推广应用中有一定的困难。本文对比验证了液液萃取法和固相萃取法在分析联苯胺的可行性。检测手段使用超高效液相色谱法分离, 荧光检测器检测, 验证其满足地表水监测需求的可行性。联苯胺是二元弱碱, 基于其理化性质, 固相萃取法对比了亲水亲脂性固相萃取柱(PEP)和弱阳离子交换柱(PWCX)的差异。

图1 联苯胺Fig.1 Benzidine

1 实验部分

1.1仪器和试剂

高效液相色谱仪, 配有二极管阵列和荧光检测器, Agilent 1260;色谱柱：ZORBAX C18柱

2.1 mm×100 mm×3.5 μm。

PEP(200 mg, 6 cc)和PWCX(150 mg, 6 cc)固相萃取小柱购自天津。

实验用水为Milli-Q 水(Millipore, Bedford, MA, USA);乙腈(CH3CN,色谱纯) 和甲醇(CH3OH, 色谱纯); 氨水(NH3·H2O, 25%, 色谱纯), 美国; 乙酸(CH3COOH, 优级纯), 乙酸铵(CH3COONH4, 优级纯), 氢氧化钠(NaOH, 优级纯)和氯化钠(NaCl, 优级纯)均购自北京化工厂。

联苯胺(美国), 纯度98%。

1.2实验流程

结合联苯胺的亲水性和弱碱性, 研究对比了液液萃取和两种固相萃取柱的富集效果, 预处理过程如图2所示。联苯胺为弱碱性化合物, 为提高萃取效率, 需在碱性条件下进行提取或富集; 有研究表明, 在碱性条件下富集, 能够避免酚类化合物的干扰[9]。

注：PEP为亲水亲脂性填料的固相萃取; PWCX为弱阳离子交换填料的固相萃取; LLE为液液萃取。全文同。图2 水样中联苯胺萃取流程Fig.2 The flow chart of extract benzidine from water

液液萃取：准确量取1.0 L水样,放于分液漏斗中，加入30 g NaCl, 用1 mol/L NaOH溶液将样品pH调节至11～12, 再用30 mL二氯甲烷分3次提取其中的联苯胺, 合并后的提取液经浓缩后转换溶剂为乙腈, 并定容为1 mL。

PEP固相萃取：PEP是亲水亲脂性的吸附填料, 适用于水溶性较强的有机物质富集, 使用前依次用甲醇(6 mL)和高纯水(6 mL)清洗。水样通过PEP柱前，用1 mol/L NaOH溶液将样品pH调节至11, 再以10 mL/min流速通过小柱, 然后用5 mL 10%甲醇水溶液清洗小柱，弃掉流出部分, 充分干燥小柱后, 用6 mL甲醇洗脱得到目标物。洗脱液经浓缩后转换溶剂为乙腈, 并定容为1 mL。

PWCX固相萃取：PWCX是亲水亲脂性的吸附填料, 由于含有[COOH]基团, 适用于弱碱性物质的富集。使用PWCX柱富集水样时, 水样保持中性，并以10 mL/min流速通过小柱，然后用6 mL 2%甲酸溶液将联苯胺固定在柱体, 再使用6 mL纯甲醇强力清洗小柱，以去除其他化合物干扰, 最后使用6 mL 2%氨水甲醇洗脱得到目标物。洗脱液经浓缩后转换溶剂为乙腈, 并定容为1 mL。

1.3仪器条件

色谱条件：色谱柱为ZORBAX C18柱 2.1 mm×100 mm×3.5 μm, 柱温为30 ℃, 流速1.00 mL/min, 进样量5.0 μL, 流动相A为甲醇, B为pH=4.5 醋酸铵-醋酸缓冲溶液, 梯度洗脱。 洗脱条件：60% B相起始并保持4 min, 然后在第8 min B相降低为50%, 第12 min B相降低至10%并保留3 min, 在第16 min回到起始状态平衡4 min。荧光检测器的激发/发射波长为290 nm/410 nm。

2 结果与讨论

2.1提取方法比较

按照图2所示的萃取流程, 进行空白加标实验, 选择最佳的萃取方式。每种方法分析样品包含全程序空白1个,空白加标3个, 其中空白加标样品中, 加标量为50 ng。3种萃取方法的空白样品中均无联苯胺检出, 加标回收率如表1所示。结果证实, PWCX柱不适用于联苯胺的提取, PEP和液液萃取(LLE)的回收率都可达到80%以上, 有较好的回收效果。对比实验流程, PEP萃取法使用的溶剂较少, 对环境的危害较少[10]; 另外, 在测定实际样品时, 液液萃取常伴有乳化效应, 造成前处理过程繁琐[11], 因此研究建议采用PEP固相萃取法提取水中的联苯胺。

表1 3种萃取方式的空白加标回收率Table 1 Recoveries of benzidine in blank spikingsamples for three extraction methods %

2.2液液萃取优化

2.2.1 萃取溶剂的选择

本实验对比了二氯甲烷、正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯4种溶剂对水体中联苯胺的萃取效率。实验方法：准确量取1.0 L高纯水, 加入联苯胺40.0 ng, 再加入30 g NaCl, 调节pH为11, 然后分别使用二氯甲烷、正己烷、甲基叔丁基醚和乙酸乙酯各60 mL×3次对水样进行萃取, 萃取液浓缩后转换溶剂为乙腈, 定容至1.0 mL, 上机测定. 对比测定结果发现, 正己烷和甲基叔丁基醚对联苯胺的萃取效率较低, 均不足50%, 乙酸乙酯和二氯甲烷的萃取效率都可以达到90%以上。由于二氯甲烷沸点较低, 易于挥发和转换溶剂, 因此选择二氯甲烷为液液萃取的萃取溶剂。需要指出的是，液液萃取提取水中目标物后，溶剂转换为甲醇或乙腈等流动相使用的溶剂体系是必要的环节[12-13]. 为了减少溶剂效应，也有方法会将样品定容为水和甲醇/乙腈的混合溶液[14]。

2.2.2 调整pH

由图1可知, 联苯胺为二元弱碱, 为提高提取效率, 需要将水样调整为碱性。研究对比了pH分别为9～10、11～12、13～14时, 二氯甲烷对空白加标后水体中联苯胺的提取效率, 其提取效率依次为69.2、85.5、75.8, 说明pH=11～12时, 二氯甲烷对水体中联苯胺有较好的提取效果。

2.2.3 样品浓缩

在加标回收实验中发现, 联苯胺的回收率不稳定, 有时甚至低于50%。通过逐步验证发现, 浓缩过程是联苯胺损失的最可能环节, 试验结果显示在样品浓缩过程中, 若溶剂量挥发至近干时, 联苯胺将损失近一半; 若溶剂剩余量小于0.3 mL时, 联苯胺的回收率可达到70%左右; 若溶剂剩余量大于等于0.5 mL时, 联苯胺的回收率可达到80%。因此, 在样品分析时需严格控制浓缩过程, 溶剂量不得少于0.5 mL。

2.3PEP固相萃取法优化

针对于联苯胺的弱碱特性, 实验对比验证了中性水样和pH值为11～12的加标回收率。 结果表明, 当样品为中性时, PEP的富集效率不足30%; 但将水样调整为碱性时, PEP富集效率可以达到80%以上。说明碱性条件 (pH=11～12)是PEP富集水体中联苯胺的必要条件。

2.4液相色谱条件确定

研究只针对联苯胺进行分析, 液相色谱条件较为简单, 使用ZORBAX C18柱 2.1 mm×100 mm×3.5 μm为分析柱, 流动相选择甲醇(A)40%和10 mmol/L乙酸铵(B)60%, 当流速为1.0 mL/min时, 在3.5 min时得到目标物(图3、图4)。为减少柱残留, 每次样品运行完毕需将样品在高有机相(≥90% A)运行不少于3 min, 且在分析下一个样品前需将仪器流动相充分平衡。

图3为联苯胺激发波长和发射波长。从图3可知，最大激发波长和发射波长分别为290、410 nm。图4为最佳激发波长和发射波长条件下得到的荧光色谱图。浓度分别为0.5、5 ng/mL。在最佳液相条件下，建立标准曲线，选择标准溶液浓度依次为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，绘制的标准曲线线性R2=0.999 9，p<0.001。

图3 联苯胺激发波长和发射波长Fig.3 The excitation wavelength and emission wavelength of benzidine

图4 联苯胺的荧光色谱图Fig.4 The fluorescence chromatogram of benzidine

2.5方法性能指标

2.5.1 方法检出限和测定下限

参照图2分析样品, 对空白加标水样进行7次平行测定, 加标量为5 ng/L, 根据《环境监测 分析方法标准制修订导则》(HJ 168—2010)[15], 计算方法的检出限和测定下限, 测定结果见表2。PEP法的平均值为4.06 ng/L, 检出限为0.9 ng/L, 定量下限为3.6 ng/L; LLE法的平均值为4.57 ng/L,检出限为1.4 ng/L, 定量下限为5.5 ng/L。两种方法均满足《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002)中联苯胺的监测需求(0.000 2 mg/L)[1]。其中, PEP法的标准偏差低于LLE法, LLE法富集后, 萃取液体及较大，在进行浓缩和溶剂转换时可能会造成样品损失或者污染。

表2 PEP和LLE的方法检出限及定量下限Table 2 The detection limits and quantitation limits of PEP method and LLE method

2.5.2 方法准确度和精密度

为检验方法准确度和精密度, 选择了3种水体：地表水、污水 (污水处理厂入水, 以生活污水为主)和某印染企业废水进行测定。但在3种水体中均未检测到联苯胺, 因此以基体加标来判别方法的准确度和精密度。

根据方法检出限、仪器的线性范围(5～100 ng/mL), 以及各种水体的特点, 地表水、污水处理厂入水和企业废水的加标量依次为10.0、40.0、80.0 ng/L, 每组样品平行测定6次。PEP、LLE的方法准确度和精密度如表3所示。

表3 PEP、LLE的方法准确度和精密度Table 3 The precision and accuracy of PEP method and LLE method

由表3可知, PEP固相萃取法测定地表水、生活污水、企业废水3种不同浓度基体加标的回收率依次为86.8%、80.4%、92.1%, 相对标准偏差小于5%; 液液萃取法测定地表水、生活污水、企业废水3种不同浓度基体加标的回收率依次为106%、98.2%、99.0%, 相对标准偏差小于20%。对比上述两种方法, PEP固相萃取法的回收率低于液液萃取法, 但是具有较好的重现性。这说明液液萃取的富集效率高于PEP固相萃取法; 但是, 液液萃取时乳化现象及浓缩时溶剂转化将会使结果重现性降低。

3 结论

利用液液萃取法和固相萃取法提取水中的联苯胺,这两种方法的精密度和准确度均较高，提取液经过液相色谱分离, 荧光法测定，液液萃取法的方法检出限为1.4 ng/L,定量下限为5.5 ng/L; PEP固相萃取法的方法检出限为0.9 ng/L，定量下限为3.6 ng/L，两种前处理方法均能够满足地表水监测需要。

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ResearchonDeterminationofBenzidinebyHPLC-FLD

ZHANG Xiulan, GUO Jing, REN Lijun, ZHU Chaofei, YANG Wenlong, LIU Jinlin, WU Zhongxiang, DONG Liang, DU Bing

State Environmental Protection Key Laboratory of Dioxin Pollution Control, National Research Center for Environment analysis & Measurement，Beijing 100029， China

X832

A

1002-6002(2017)03- 0160- 05

10.19316/j.issn.1002-6002.2017.03.24

2016-05-14;

2016-10-24

重大仪器专项“新型高速、高灵敏度、高通量色谱分析仪器的开发与应用”(2012YQ14000804)；环保重大公益“地下水系统中新型污染物监测技术与源解析研究”(201309001)

张秀蓝(1983-)，女，山西长治人，博士，副研究员。