正交试验提取齿瓣石斛多糖工艺优化研究

王洪云+王文静+马光宇+张尹+李铭

摘要：目的 优化齿瓣石斛多糖提取工艺。方法 采用正交设计，考察提取温度、提取时间、提取次数和料液比等4个影响因素。结果 最佳提取工艺条件为：温度100 ℃、料液比 1：25、提取时间 1 h、提取次数 2次。结论 该提取工艺稳定可行，多糖提取率高。

关键词：齿瓣石斛；多糖；正交设计；提取工艺

中图分类号：R2842 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2017）10-0075-02

石斛是我国传统名贵中药材，为兰科（Orchidaceae）石斛属（Dendrobium）植物新鲜或干燥茎的统称，具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳等功效[1]。石斛属植物中药用的有金钗石斛、铁皮石斛、马鞭石斛、黄草石斛、环草石斛等5种，但由于石斛资源紧缺，混作药用石斛约有50余种，其中，以齿瓣石斛规模较大[2-4]。

齿瓣石斛Dendrobium devonianum Paxt，又名紫皮石斛、香棍草、大黄草，为西南各省区石斛药材主要习用品种之一，也是云南重点开发的药物资源。石斛多糖是齿瓣石斛等多种石斛中的主要有效成分之一，含量在3%-46%之间[5-7]，其生物活性十分显著，在食品药品工业中广泛应用。但是各种多糖含量和提取率差异较大，本研究通过正交试验对齿瓣石斛多糖提取工艺进行优化，为今后的深入开发利用提供一些参考。

1 材料与方法

11 仪器 Shimadzu UV-2450紫外光谱仪（日本岛津公司）、旋转蒸发仪（瑞士步琪公司）、PL-203电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）、FZ102微型植物试样粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）。

12 试剂 葡萄糖（中国药品生物制品检验所）、苯酚（天津市化学试剂三厂）、硫酸、乙醇等均为分析纯（成都科龙化工）。

13 药材 齿瓣石斛，购于云南省龙陵县，经云南中医学院钱子刚教授鉴定为齿瓣石斛（Dendrobium devonianum Paxt）。鲜品，洗净，60℃烘干，粉碎过60目筛，置干燥器中，备用。

14 试验方法 按《中华人民共和国药典》（2015版）一部[8]铁皮石斛多糖含量测定方法测定齿瓣石斛多糖含量。

141 溶液的制备

1411 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖标准品1235 mg，置100 mL容量瓶中加适量蒸馏水溶解，稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（每1 mL含葡萄糖01235 mg）。

1412 供試品溶液的制备。取样品粉末约03 g，精密称定，加水200 mL，加热回流2 h，放冷，转移至250 mL容量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液4 mL，置15 mL离心管中，精密加入无水乙醇10 mL，摇匀，冷藏1 h，取出，离心（转速为每分钟4000转）20 min，弃去上清液（必要时滤过），沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8 mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。测定方法：精密量取供试品溶液10 mL，置于10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自精密加入5%苯酚溶液1 mL起，依法测定吸光度，按线性回归方程计算多糖含量。

142 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液01、02、04、06、08、10 mL，分别置于10 mL具塞试管中，各加水补至10 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL（临用配置），摇匀，再精密加入硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出，置冰浴中冷却5 min，以蒸馏水为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在488 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：y=00701x+00073，r=09998（n=6）。结果表明：葡萄糖在1764～17643 μg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系，见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

143 正交设计 主要考察提取温度、提取时间、提取次数和料液比等四个影响因素，见表 1。以此进行 L9（3）4 4因素3水平正交试验。

2 结果与分析

21 正交试验结果 对提取温度、提取时间、提取次数和料液比等四个影响因素进行 L9（3）4 正交试验，结果见表2。由正交试验极差分析可知，因素主次顺序为 A>D>B>C，即最重要的因素为提取温度，其次是料液比，再次是提取时间，最后是提取次数。最佳组合为 A3B1C2D3，即提取工艺参数为温度100 ℃、料液比 1：25、提取时间 1 h、提取次数 2次。

22 重现性试验 照优选出的最佳提取工艺制备5份样品液，测定吸光度值，计算多糖提取率，RSD=325%，结果表明该方法具有良好的重现性。

23 精密度试验 精密吸取同一样品液，平行取样5次，测定吸光度值，计算RSD=317%，结果表明该方法精密度良好。

24 最佳提取工艺验证试验 按照正交结果进行验证试验，齿瓣石斛多糖得率为 379%，RSD=261%（n=3）。结果表明该工艺稳定。

3 结论

本试验研究建立了齿瓣石斛多糖提取工艺，采用正交设计对提取温度、提取时间、提取次数和料液比等四个影响因素进行考察，结果表明提取温度对提取率影响最大，其次是提取料液比，再次是提取时间，影响最小的是提取次数，最佳提取工艺为温度100 ℃、料液比 1：25、提取时间 1 h、提取次数 2次，该工艺稳定性好，可行。

参考文献：

[1]江苏新医学院中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1985：586

[2]明兴加，张明，陶文静，等名贵中药齿瓣石斛的开发前景[J].重庆中草药研究，2006，54（2）：51

[3]李安华，沈妍，赵兴灿，等云南产17种枫斗类石斛资源和原植物初步的研究[J].时珍国医国药，2011，22（3）：723

[4]王洪云，李铭，郝俊杰，等齿瓣石斛研究进展[J].中华中医药学刊，2014，32（11）：2732-2735

[5]李亚芳，张晓华，孙国明石斛中总生物碱和多糖的含量测定[J].中国药事，2002，16（7）：426-428

[6]吴迪，王岩，巴哈尔古丽·卡哈尔，等齿瓣石斛多糖提取及脱蛋白工艺研究[J].时珍国医国药，2010，21（11）：2841-2843

[7]叶子，芦叶，薛亚甫，等铁皮石斛专属性成分的分离制备及专属性研究[J].中国中药杂志，2016，41（13）：2481-2486

[8]中国药典一部[S].2015：282-283endprint