滇重楼连续灌胃对肠黏膜功能障碍的抗炎保护作用

熊伟+陈思如+修光辉+凌斌+孙洁+刘萍

摘要：目的 觀察不同剂量滇重楼连续灌胃对肠黏膜功能障碍的影响，并探讨其与全身炎症反应的相关性。方法 构建大鼠肠黏膜功能障碍模型（LPS 15mg/kg），给予不同剂量滇重楼（20、40、80mg/kg）连续灌胃，于24Hr统计动物存活率及小肠推进率，取动脉全血，检测动脉血二氧化碳分压（PaCO2）、肌酸激酶（CK）、凝血酶原时间（PT）、谷草转氨酶（AST）和尿素氮（BUN）的含量，于1、7days取小肠行病理组织学检查，于1、3、7、14days取材动脉全血及小肠，ELISA法检测血浆中二胺氧化酶（DAO）及小肠中HMGB1的含量。结果 模型组大鼠与对照组比较全血中CK、PT、AST、BUN含量升高，PaCO2含量下降，存活率及小肠推进率显著下降，差异有统计学意义（P<005）；不同浓度滇重楼治疗组与模型组比较全血中CK、PT含量下降，差异有统计学意义（P<005），PaCO2含量升高，存活率及小肠推进率升高，有统计学意义（P<005）；但治疗组与模型组比较AST及高剂量组BUN差异无统计学意义（P>005）。1、3、7d时模型组血浆中DAO和HMGB1含量高于对照组，而1、3、7d时滇重楼治疗组低于模型组，差异有统计学意义（P<005），14d时相差异无统计学意义（P>005）。结论 滇重楼连续灌胃可能通过下调晚期炎症因子HMGB1表达，抑制全身炎症反应，从而改善肠黏膜屏障功能，发挥抗炎保护作用。

关键词：滇重楼；肠黏膜功能障碍；脂多糖；高迁移率族蛋白B1

中图分类号：R2855 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2017）10-0068-04

Anti-inflammatory and Protective Effects of Continuous Intestine Administration

of Paris Polyphylla var Yunnanensison on Intestinal Mucosal Dysfunction

XIONG Wei， CHEN Si-ru， XIU Guang-hui， LING Bin， SUN Jie， LIU Ping

（Department of Severe Cases， the Fourth Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650021， China）

【Abstract】Objective： To observe the effect of different doses of Paris polyphylla var yunnanensison on intestinal mucosal dysfunction and to explore its correlation with systemic inflammatory response Methods： The rat model of intestinal mucosal dysfunction （LPS 15mg/kg） was established and the rats were continuously administrated with different doses （20， 40， 80mg/kg） of Paris polyphylla The survival rate and the small intestine propulsion rate were measured at 24 hours The rats were sacrificed to take their arterial whole blood to determine the contents of PaCO2， creatine kinase （CK）， prothrombin time （PT）， aspartate aminotransferase （AST） and urea nitrogen （BUN） The small intestine was examined by histopathology at the 1st and 7th day The arterial whole blood and small intestine were taken to determine diamines oxidase （DAO） and HMGB1 in the small intestine by ELISA at the 1st， 3rd， 7th and 14th day Results： Compared with that of the control group， the level of CK， PT， AST and BUN in the whole blood of the model group increased， but the content of PaCO2 decreased The survival rate and the small intestine propulsion rate significantly decreased （P<005） and the difference was statistical significance （P<005） Compared with that of the model group， the content of CK and PT in the whole blood of the different doses groups decreased and the difference was statistical significance （P<005）， but PaCO2 increased and the survival rate and the small intestine propulsion rate increased and the difference was statistical significance （P<005） But there was no significant difference between the treatment group and the model group in AST and high dose group （P>005） The levels of DAO and HMGB1 in the plasma of the model group were higher than those of the control group at the 1st， 3rd and 7th day of modeling and the difference was statistically significant （P<005）， but in the 14th day of modeling， the difference was not statistically significant （P>005） Conclusion： Continuous intestine administration of Paris Polyphylla var Yunnanensison may inhibit systemic inflammatory response by down-regulating the expression of late inflammatory cytokines HMGB1， thereby improve intestinal mucosal barrier function and exert anti-inflammatory and protective effectendprint

【Key words】Paris polyphylla var；Yunnanensison；intestinal mucosal dysfunction；lipopolysaccharide；HMGB1

肠黏膜功能障碍是脓毒症患者常见并发症之一，也是脓毒症发病的始动环节，其机制包括肠黏膜细胞凋亡、肠通透性增加、胃肠动力失调、菌群移位、炎症因子级联释放等，可使肠黏膜屏障（机械、免疫、生物、化学屏障）严重受损，从而加速全身炎症反应综合征（SIRS）向多器官功能障碍综合征（MODS）发展[1-3]。肠黏膜功能障碍常表现为不同程度的食欲不振、便秘、腹泻、腹胀、腹痛等，严重者甚至出现便血、肠梗阻、腹膜炎等。研究表明，脓毒症患者的疾病严重程度与晚期炎症因子高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）呈相关性[4]，因其广泛存在于真核细胞内，病理状态下可诱导其他炎症因子释放或靶细胞损伤，在脓毒性肠黏膜功能障碍的进展中具有枢纽作用。

黃彦峰等[5]报道重楼水提液可调节小肠运动从而治疗肠道功能紊乱，其机理可能与M胆碱能受体、肾上腺素能系统有关。重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 可诱导小鼠淋巴细胞增殖效应，促进小鼠粒/巨噬细胞克隆形成细胞（GM-CFC）活化，增强细胞吞噬能力，直接参与抗炎反应[6]；此外，重楼还可刺激下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）分泌糖皮质激素间接参与抗炎反应[7]。在此基础上，拟通过脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的肠黏膜功能障碍模型，观察不同剂量滇重楼连续灌胃对肠黏膜功能障碍的影响，并探讨其与全身炎症反应的相关性。

1 材料与方法

11 材料 滇重楼由昆明医科大学第四附属医院药剂科提供。清洁级健康成年SD大鼠雌性150只，体重（220±10）g，由解放军昆明总医院科研实验中心提供（实验动物质量合格证号：SYXK（滇）2015-2016）。活性炭末购于天津登科公司，羟甲基纤维素钠购于上海申光公司。脂多糖购于美国Sigma公司；血浆二胺氧化酶（DAO）和晚期炎症因子HMGB1 ELISA试剂盒购于武汉华美公司。

12 方法

121 动物分组及处理 清洁级健康雌性SD大鼠150只，自由饮食，随机编号为5组，30只/组，分对照组、模型组、低剂量组、中等剂量组、高剂量组。各组大鼠禁食6h后，低、中、高剂量治疗组分别予以20、40、80mg/kg滇重楼连续灌胃，对照组及模型组给予相同剂量生理盐水灌胃；除对照组外，其余组经腹腔注射LPS 15mg/kg，对照组给予相同剂量生理盐水腹腔注射；观察大鼠外观、习性及各项生理反应变化，正常饮食，精心护理。

122 动物存活率及小肠推进率的影响 于造模后24hr后，统计各组动物存活情况。禁食6h后，滇重楼治疗组分别予以20、40、80mg/kg滇重楼连续灌胃，对照组及模型组给予相同剂量生理盐水，给药后30min，各组动物予以5%炭末悬液（活性炭末+05%羟甲基纤维素钠）25ml/100g灌胃，20min后处死大鼠，结扎胃幽门部及回盲部，取小肠直线平铺下测量，以幽门至回盲部为小肠总长度，以幽门至炭末推进前段为炭末推进距离，炭末推进率（%）=炭末推进距离/小肠总长度×100%。

123 实验室指标检测 于造模治疗24hr后，4%水合氯醛1ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，经腹主动脉取动脉血进行实验室检测，分别检测各组动物血二氧化碳分压（PaCO2）、肌酸激酶（CK）、凝血酶原时间（PT）、谷草转氨酶（AST）和尿素氮（BUN）观察模型成立及脏器功能变化情况。

124 小肠病理组织学检测 于1、7days，分别取小肠组织用10%多聚甲醛溶液固定3～24h，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、常规切片和苏木素-伊红染色后，封片镜检观察小肠组织损害程度。

125 ELISA法检测DAO和HMGB1水平 于1、3、7、14days，分别取血浆制成检测标本，按每孔100ul分别加标准品或待测样本，37℃温育，依次加生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液、底物溶液、终止溶液，终止反应后酶标仪测量各孔OD值，对照标准品进行统计分析。

13 统计学处理 使用SPSS 200统计软件进行统计学处理。全部数据均用均数±标准差（x±s）表示，P<005有统计学意义；P>005无统计学意义。各实验组的组间及组内均采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）对资料进行统计处理。率的比较用完全随机设计资料χ2检验，P<005提示两个率差异有统计学意义，P>005提示两个率之间差异无统计学意义。

2 结果

21 动物存活率及小肠推进率的影响 模型组大鼠与对照组比较动物存活率及小肠推进率下降，差异有统计学意义（P<005）；滇重楼治疗组（低、中、高）与模型组比较动物存活率及小肠推进率上升，差异有统计学意义（P<005），见表1。

22 生化指标检测结果 模型组大鼠与对照组比较全血中CK、PT、AST、BUN含量升高，PaCO2含量下降，差异有统计学意义（P<005）；滇重楼治疗组（低、中、高）与模型组比较全血中CK、PT含量下降，差异有统计学意义（P<005），PaCO2含量升高，差异有统计学意义（P<005）；但治疗组与模型组比较AST及高剂量组BUN，差异无统计学意义（P>005），见表2。

22 小肠病理组织学检测 对照组可见黏膜组织结构正常，腺体完整，无水肿、出血、白细胞浸润。模型组1d时可见黏膜明显水肿，腺体部分不完整，黏膜下及肌层内白细胞浸润增多，7d时水肿及白细胞浸润较前明显减轻。不同浓度滇重楼治疗组，1d时各组呈现出不同程度的黏膜水肿及白细胞浸润，与模型组1d时组织结构接近，但中等剂量组和高剂量组较轻；7d时各组与对照组组织结构接近，仅轻度水肿，少量白细胞浸润。见图1。endprint

23 滇重楼对大鼠肠黏膜功能保护作用 1d、3d、7d时模型组与对照组比较血浆中DAO含量升高，差異有统计学意义（P<005）；1d、3d、7d时滇重楼治疗组（低、中、高）与模型组比较血浆中DAO含量下降，差异有统计学意义（P<005）。14d时各组之间DAO无明显差别，差异无统计学意义（P>005）。见表3，图2。

24 滇重楼对大鼠小肠HMGB1的表达影响 1d、3d、7d时模型组与对照组比较小肠中HMGB1蛋白含量升高，差异有统计学意义（P<005）；1d、3d、7d时滇重楼治疗组（低、中、高）与模型组比较小肠中HMGB1蛋白含量下降，差异有统计学意义（P<005）。14d时各组之间HMGB1无明显差别，无统计学意义（P>005）。见表4，图3。

3 讨论

《滇南本草》记载重楼“为外科之至药，主治一切无名肿毒，攻各种疮毒痈疽，发背痘疔等症最良”。姚勤等[8]采用耳肿法及毛细管通透性法观察不同剂量重楼醇提物的抗炎作用，结果发现大、中剂量的重楼醇提物对二甲苯所致的耳廓肿胀及醋酸所致的毛细血管渗漏有明显的抑制作用。滇重楼的抗炎特性在体内外实验均得到证实，因云南独有的气候孕育了功效奇特的地道药材，具有广泛的市场开发和临床推广价值，结合前期实验研究，滇重楼预处理可明显改善脓毒症大鼠转归及预后。但是，在肠黏膜功能障碍中滇重楼是否可通过抑制晚期炎症因子HMGB1发挥抗炎保护作用。

本实验发现，模型组与对照组相比大鼠血中CK、PT、AST、BUN含量升高，PaCO2和小肠推进率下降，差异有统计学意义（P<005），表明脓毒症进展过程中包括心、肝、肾、肠、凝血等系统都受到不同程度的影响，表现出多器官功能障碍，且模型组大鼠死亡率60%，符合脓毒症模型成功建立指标。经滇重楼连续灌胃后，1d时治疗组小肠推进率高于模型组，但低于对照组；1、3、7d时模型组血浆中DAO和HMGB1含量高于对照组，而1、3、7d时滇重楼治疗组低于模型组，差异有统计学意义（P<005），14d时相差异无统计学意义（P>005）。表明滇重楼能够促进小肠推进，降低黏膜通透性，抑制炎症因子释放，从而稳定肠道屏障功能，调整肠道蠕动，减少细菌移位及内毒素转移，减缓脓毒症进程，从而发挥肠道保护作用，在治疗晚期炎症反应得以控制，肠黏膜功能逐渐恢复，趋于正常。但治疗组AST和BUN（高剂量组）与模型组差异无统计学意义（P>005），可能与滇重楼的肝肾毒性有关，在临床运用中应注意剂量及疗程的把握。据报道[9-12]，滇重楼等中药可能刺激分泌营养因子、抗炎因子、神经介质等神经-体液途径发挥抗炎保护作用，减轻肠黏膜功能障碍患者腹胀、腹泻、腹痛等症状，从而改善转归及预后，降低住院费用、缩短住院周期、提升住院质量。

病理条件下，晚期炎症因子HMGBl与各种炎症因子一起参与炎症反应，如细胞损伤、坏死可激活免疫细胞分泌HMGB1，使免疫细胞向损伤部位募集，同时通过其特异性受体（如RAGE、TLR2、TLR4、NF-κB）诱导其他炎症因子释放或靶细胞损伤，形成瀑布样级联损害[13-15]。在本实验中，模型组小肠中HMGB1蛋白表达水平高于对照组，而滇重楼治疗组低于模型组（P<005），说明滇重楼可能对晚期炎症因子HMGB1有下调作用。综上所述，滇重楼预处理可能通过下调晚期炎症因子HMGB1表达，而改善小肠黏膜屏障通透性，发挥抗炎保护作用。

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